2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析

王金章，陈宏彬，张拥军，翁育伟，吴春敏，郑奎城，严延生



2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析

王金章1，陈宏彬1，张拥军1，翁育伟1，吴春敏2，郑奎城1，严延生1

1.福建省疾病预防控制中心，福建省人兽共患病研究重点实验室，福州350001；2.南平市疾病预防控制中心，南平353000

摘要：目的测定2014年南平市登革暴发相关登革病毒E基因序列，探讨其输入来源及基因型别。方法将患者急性期血清接种C6/36细胞，分离登革病毒，通过RT-PCR进行血清型鉴定，扩增全长E基因，测定序列并绘制系统进化树。结果共分离到4株DENV-1，2株DENV-2，扩增并测序获得E基因全长序列，4株南平地区DENV-1型分离株之间同源性为100%，与D13459(Donguang)分离株同源性也高达99.7%；2株DENV-2型分离株与DENV2/CN/GZ05/2014分离株的同源性均达100%。系统进化分析发现，4株DENV-1病毒株与来自广东及印度的毒株处于同一进化树分支，均为基因Ⅴ型；2株DENV-2病毒株与来自广东及新加坡的毒株处于同一进化树分支，均为基因Ⅳ型。结论福建省南平市本次登革热本地病例暴发可能是由广东或者东南亚地区的登革热输入病例引起的。

关键词：登革病毒；E基因；序列分析；系统进化树

Supported by the National Mega-Project of Science & Technology for Infectious Diseases in China.(No.2012ZA10004-210) and the Innovative Projects of Medical Sciences in Fujian Province(No.2015-CXB-13)

登革病毒(dengue virus, DENV)是一种通过伊蚊传播的虫媒病毒, 主要流行于热带和亚热带地区，自然界存在4种血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，可引起登革热(dengue fever，DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)等急性传染病。近几十年登革热发病率大幅度上升，资料显示，全世界约3.9亿的人口面临感染登革热及登革出血热的危险[1-2]，美洲、东南亚和非洲是登革热重灾区。

DENV是单股正链RNA病毒，E基因编码病毒的主要包膜蛋白，在病毒与宿主细胞相互作用过程中发挥着重要的功能，常用于病毒基因进化分析研究[3]。自2005年至2014年9月1日，南平市仅在2008和2009年各有1例输入性登革热病例报道，并无本地病例的出现，2014年9月及10月首次出现一起较大规模的登革热本地病例暴发，共报告有本地病例122例。本文对2014年9月福建省南平市首次发现的本地暴发病例中分离获得DENV1型4株、DENV2型2株病毒株，通过RT-PCR扩增毒株的E基因并测定其基因序列，与GenBank中已经公布的序列进行比对和进化分析，以期了解其序列特征与可能的传播来源。

1材料与方法

1.1试剂及标本来源

1.1.1试剂QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自QIAGEN公司、一步法RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司、RPMI 1640培养基购自Gibco公司。

1.1.2标本来源 2014年9月南平市建瓯市东峰镇、吉阳镇本地登革热患者急性期血清。

1.2引物设计与合成DENV病毒型别鉴定引物序列参照登革热防治手册[4]； DENV1、DENV2 完整E基因特异性扩增引物参照黄萌等[5]设计的序列合成，见表1,表2；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1　DENV1、DENV2分型RT-PCR扩增引物序列

表2　DENV1、DENV2E基因RT-PCR扩增引物序列

1.3病毒培养及RNA提取将血清标本用Hank’s液按1∶10稀释至0.5 mL备用。将稀释好的标本接种6孔细胞培养板上培养好的单层C6/36白蚊伊蚊传代细胞，28 ℃、5%CO2吸附1 h，补充维持液(含2%的小牛血清的RPMI 1640培养基)至3 mL，28 ℃、5%CO2培养观察至75%细胞出现病变。收获感染细胞和培养液体，取140 μL培养液体按QIAamp Viral RNA Mini Kit提取试剂盒操作步骤提取病毒RNA，其余-70 ℃保存。

1.4RT-PCR扩增鉴定病毒型别一步法RT-PCR试剂盒操作说明配制50 μL体系RT-PCR反应混合液，PCR扩增体系配置采用正向引物D1与反向引物TS1、TS2。反应条件为94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，反应30循环；72 ℃ 10 min。2.0%浓度琼脂糖电泳分析，确定病毒型别。

1.5E基因片段扩增及产物的纯化测序一步法RT-PCR试剂盒操作说明配制50 μL体系RT-PCR反应混合液，引物分别使用DENV1E-F/DENV1E-R和DENV2E-F/DENV2E-R扩增相应型别的E基因，反应条件为94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 2 min，反应40循环； 72 ℃ 10 min。采用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，参照试剂盒说明书进行。纯化后送上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。

1.6病毒基因序列分析及构建进化树测序结果用DNAStar软件中的SeqMan进行拼接， 获得登革病毒E 基因全长序列。从GenBank下载具有代表性的登革病毒E 基因序列，通过BLAST分析了解其一致性最高的序列来源，并用DNAMAN进行同源性分析，通过MEGA6.0 构建Neighbor-Joining(NJ)系统进化树分析。

2结果

2.1病毒分离患者血清接种C6/36细胞后，在第5 d左右出现空泡样病变，1周左右细胞均出现典型细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)：细胞形态改变，折光性下降，出现肿大、蚀斑、空泡和融合等现象，部分细胞坏死脱落(图1)。

1: Uninfected C6/36 cells; 2: Normal cells 7 days; 3: CPE 7 days after infected with dengue patient serum.

图1接种登革热患者标本前后C6/36细胞形态

Fig.1Morphologic changes of C6/36 cells after infected with dengue patient serum

2.2RT- PCR鉴定病毒型别以病毒细胞培养液体中提取的病毒RNA 为模板，用(D1+TS1)、(D1+TS2) 两对引物进行RT-PCR扩增， 经2.0%琼脂糖电泳观察结果。FJ/210/2014、FJ/211/2014、FJ/212/2014、FJ/213/2014的扩增片段与预期片段482 bp一致，证实为DENV-1型；FJ/269/2014、FJ/270/2014的扩增片段与预期片段119 bp一致，证实为DENV-2型(图2)。6株病毒分离毒株标本基本信息见表3。

M: 100 bp DNA marker; 1: FJ/210/2014; 2: FJ/211/2014; 3: FJ/212/2014; 4: FJ/213/2014; 5: DENV1 positive control; 6: FJ/269/2014; 7: FJ/270/2014; 8: DENV2 positive control; 9: DENV1 negative control; 10: DENV2 negative control.

图2RT-PCR型别鉴定DENV1、DENV2结果

Fig.2Serotype identification of DENV1 and DENV2 by RT-PCR

2.3病毒E 基因全长扩增以细胞培养液提取的病毒RNA为模板，用DENV1E-F+ DENV1E-R 和DENV2E-F+ DENV2E-R两对引物分别进行

表3　病毒分离毒株标本基本信息

RT-PCR 扩增，经1.0%琼脂糖电泳观察，分别获得了与预期片段一致的E基因扩增片段(DENV-1：1 609 bp, DENV-2：1 610 bp)(图3)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: FJ/210/2014; 2: FJ/211/2014; 3: FJ/212/2014; 4: FJ/213/2014; 5: FJ/269/2014; 6: FJ/270/2014.

图3DENV1、DENV2 E基因全长RT-PCR扩增结果

Fig.3RT-PCR amplification of DENV1 and DENV2 E gene

2.4E基因BLAST及同源性分析通过BLAST分析，DENV-1型的4株分离株均与2013年广东东莞的分离株D13459(Donguang)具有较高的一致性，DENV-2型的2株分离株均与2014年广东广州的分离株DENV2/CN/GZ05/2014具有较高一致性(表4)。经DNAMAN 8.0比较其同源性，4株南

平DENV-1型分离株之间同源性为100%，与D13459(Donguang)分离株同源性也高达99.7%；2株DENV-2型分离株与DENV2/CN/GZ05/2014分离株的同源性均达100%。

2.5E基因系统进化树分析4株DENV-1病毒E基因全长序列与GenBank中29株国内外具有一定代表性的的登革病毒株E基因序列构建NJ系统进化树并分析(图3)，其结果显示：E基因进化树能将DENV-1的基因型较好的区分；4株DENV-1病毒株与来自广东及印度的毒株处于同一进化树分支，均在基因Ⅴ型的分支。2株DENV-2病毒E基因序列与GenBank中30株国内外具有一定代表性病毒株E基因序列构建NJ系统进化树并分析(图4)，结果显示：E基因能用以对DENV-2的基因型分型分析；2株DENV-2病毒株与来自广东及新加坡的毒株处于同一进化树分支，均归属于基因Ⅳ型的分支。

A: DENV1 phylogenetic tree; B: DENV2 phylogenetic tree.Strains are denoted by GenBank accession number, country of isolation, year of isolation.

IsolatenameStrainswiththehighestidentityStrainsLocationofisolateYearIDofGenBankMaxidentityD1/FJ/210/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D1/FJ/211/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D1/FJ/212/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D1/FJ/213/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D2/FJ/269/2014DENV2/CN/GZ05/2014Guangdong2014KP01254699%D2/FJ/270/2014DENV2/CN/GZ05/2014Guangdong2014KP01254699%

3讨论

本次研究构建系统进化树分析结果显示，DENV-1、DENV-2病毒E基因均能很好的进行病毒基因分型，4株DENV-1型毒株间同源性达100%，而2株DENV-2毒株间的同源性也达100%，因此我们认为这是分别由同一DENV-1型病毒传染源和同一DENV-2型病毒传染源造成的两起暴发疫情。DENV-1与来自广东的毒株(登录号：KJ545479)及印度的毒株(登录号：JN415507)亲缘关系最近，DENV-2也与广东毒株(登录号：KP012546)及新加坡毒株(KM279580)亲缘关系最近，且当时广东及东南亚地区正处于登革热暴发流行时期。流行病学调查显示南平暴发所在地与广东和东南亚地区存在一定的贸易人口流动。系统进化树分析结合流行病学调查资料表明，两个血清型的病毒株可能是来自广东或者东南亚地区的输入性登革热病例。

目前多数学者认为我国登革热的流行方式属于输入性病例引起的本地暴发流行[6]。关于我国是否存在登革热的自然疫源地目前仍存在较大的争议。由于登革热主要传播媒介之一的白蚊伊蚊在在我国南方省市普遍存在，在我省也分布广泛[7]，且我省地处沿海地区，随着对外开放的扩大，国际商旅活动、劳务输出的日益频繁，来往登革热疫区的出入境人员数量众多，极易发生输入性病例引起本地暴发流行。因此，对境外输入性登革热病例的防控一直是我省的工作重点。然而随着国内近年来部分地区登革热病例暴发疫情的发生，以及本次南平首次本地病例的暴发，提示着我省应该加强国境内输入性病例的防控工作，提高我省非沿海地区登革热防控意识，从而较好的防止输入病例引起本地暴发流行的发生。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.014

通讯作者：严延生，Email:yysh@fjcdc.com.cn

中图分类号：R373.3

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0281-05

Corresponding author:Yan Yan-sheng, Email: yysh@fjcdc.com.cn

收稿日期：2015-05-19；修回日期:2015-11-09

Sequence analysis for E genes of autochthonous dengue virus isolates from Nanping, Fujian Province, 2014

WANG Jin-zhang1,CHEN Hong-bin1,ZHANG Yong-jun1,WENG Yu-wei1,WU Chun-min2,ZHENG Kui-cheng1,YAN Yan-sheng1

(1.FujianProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China;2.NanpingCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanping353000,China)

Abstract:In September 2014, an autochthonous outbreak of dengue fever emerged in Nanping, Fujian Province. In order to identify serotypes of the outbreak-related dengue viruses and track probable transmission sources, serum samples of patients at acute phases were inoculated on C6/36 cell lines. Serotypes were initially tested by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), full-length fragments of E gene were amplified by RT-PCR, and were sequenced. A phylogenetic tree was drawn by neighbor-joining (NJ) method. Among the four DENV-1 strains and two DENV-2 strains isolated during the outbreak, it was indicated from BLAST analyses of sequence data that DENV-1 strains showed 99.7% sequence homology with strain D13459 (Donguang) from Guangdong in 2013, and that DENV-2 strains were identical to strain DENV2/CN/GZ05/2014 from Guangdong in 2014. Phylogenetic analysis also indicated that outbreak-associated DENV-1 strains were classified as genotype Ⅴ and DENV-2 strains were assigned to genotype Ⅳ. Therefore, it was suggested from epidemiologic and molecular evidence that DENV-1 viruses might originate from Guangdong or India, and that DENV-2 viruses might be introduced from Guangdong or Singapore.

Keywords:dengue virus; E gene; sequence analysis; phylogenetic tree