补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织水通道蛋白4表达及血-脑脊液屏障通透性的影响研究

刘绍晨，吴晓光，杨 岚，李义学，仇志富



·论著·

·中医·中西医结合研究·

补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织水通道蛋白4表达及血-脑脊液屏障通透性的影响研究

刘绍晨，吴晓光，杨 岚，李义学，仇志富

目的探讨补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织水通道蛋白4(AQP4)表达及血-脑脊液屏障通透性的影响。方法2014年3月—2015年11月，采用随机数字表法将成年雄性SPF级SD大鼠分为假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组，各24只。其中模型组、补阳还五汤各剂量组制备脑出血模型。造模后第2天起，补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组灌胃补阳还五汤，药量分别为13.2、26.5、53.0 g·kg-1·d-1，连续给药14 d，假手术组及模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液。免疫组织化学法检测磷酸化肌醇磷脂3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)表达水平，免疫荧光标记法检测AQP4表达水平，干湿重法检测脑组织含水量，甲酰胺法检测血-脑脊液屏障通透性〔以依文思蓝(EB)含量表示〕。结果假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组PI3K、AKT表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组PI3K表达水平高于模型组；补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AKT表达水平高于模型组(P<0.05)。5组AQP4表达水平比较，差异有统计学意义(F=95.79，P<0.001)；其中补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AQP4表达水平高于模型组(P<0.05)。5组脑组织含水量比较，差异有统计学意义(F=16.21，P<0.001)；其中补阳还五汤高剂量组脑组织含水量低于模型组(P<0.05)。5组脑组织EB含量比较，差异有统计学意义(F=60.05，P<0.001)；其中补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组脑组织EB含量低于模型组(P<0.05)。结论补阳还五汤能够减轻脑出血诱发的脑水肿，其机制可能与其激活PI3K/AKT信号转导通路，调控AQP4极性表达，降低血-脑脊液屏障通透性有关。

脑出血；补阳还五汤；脑水肿；水通道蛋白质4；血脑屏障

刘绍晨，吴晓光，杨岚，等.补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织水通道蛋白4表达及血-脑脊液屏障通透性的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(21)：2557-2561.[www.chinagp.net]

LIU S C，WU X G，YANG L，et al.Effects of Buyanghuanwu decoction on aquaporin 4 expression and the permeability of the blood brain barrier in cerebral hemorrhage rats[J].Chinese General Practice，2016，19(21)：2557-2561.

脑出血占所有脑卒中的10%～15%，具有高发病率、高致残率及高病死率，是最严重的一种脑卒中类型，目前尚无较好的方法提高脑出血患者的生存率或改善其生活质量[1]。研究表明，脑出血后继发性损伤在患者神经功能恶化过程中发挥重要作用，而脑出血后脑水肿则是继发性损伤中的重要环节之一[2]。水通道蛋白4(AQP4)是水通道蛋白家族(AQPs)在脑组织中含量最丰富、分布最广泛、功能最重要的跨膜转运蛋白，参与介导水分子的跨膜转运，当脑出血时脑组织中存在AQP4极性表达的缺失，促进出血性脑水肿的发生[3]。补阳还五汤是一种临床上治疗缺血性脑卒中的常用方药，具有增强微血管抗损伤能力，减轻脑缺血诱发的脑组织水肿等作用[4]，但是其抑制脑水肿作用的具体机制仍不明确。研究发现，脑组织中磷酸化肌醇磷脂3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号转导通路激活后能够介导或者调控与凋亡、水肿密切相关的蛋白或基因等发生相应变化来实现脑保护作用，而其发挥显著效应的前提是药物能够降低血-脑脊液屏障通透性[3]。本研究采用Rosenberg法建立大鼠脑出血模型，检测PI3K、AKT、AQP4表达水平的变化，探讨补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织水肿及血-脑脊液屏障通透性的影响及其作用机制。

本研究背景：

脑出血属于中医学“卒中”“薄厥”“中风”范畴，具有高发病率、高病死率、高致残率、高复发率的特点，是脑卒中中最为严重的一种。脑出血后继发脑水肿是患者神经功能恶化的重要影响因素。从机制上讲，出血性疾病要慎用活血祛癖之药，而脑出血虽为出血性疾病，但《血证论》云:“既是离经之血，虽清血、鲜血亦是癖血”“总以祛癖为要”。现代药理学研究表明，某些活血化癖药具有加速和促进血肿溶化和吸收，以解除脑受压的作用。补阳还五汤是益气活血的代表方，希望能为“活血化瘀药”应用脑出血治疗，加速和促进血肿溶化和吸收，解除脑受压的程度提供新思路。

1　材料与方法

1.1实验动物成年雄性SPF级SD大鼠120只，体质量230～250 g(北京维通利华实验动物技术有限公司)。大鼠采用随机数字表法分成假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组，每组24只。大鼠在室温26～28 ℃环境下饲养，自由进食进水，自然光照。

1.2实验药品及试剂补阳还五汤由生黄芪120.0 g、当归尾6.0 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龙3.0 g、桃仁3.0 g、红花3.0 g组成，购自承德大药房，通过水煎醇沉法制备成浓度为5.3 g/ml的水煎醇沉物。兔抗大鼠PI3K、AKT多克隆抗体购自武汉博士德生物科技有限公司；兔抗大鼠AQP4单克隆抗体购自Abcam公司；其他试剂为国产分析纯。1.3动物模型制备及给药2014年3月—2015年11月在承德医学院基础医学研究所完成本实验，参照LIEW等[2]方法制备大鼠脑出血模型，SD大鼠经腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，取俯卧位固定于鼠脑立体定位仪上，局部消毒后，切开大鼠皮肤，使其暴露颅骨，进行钻孔，在大鼠的前囱后方约1.4 mm，右旁开约3.2 mm处垂直进针，进针深度约为5.6 mm，可在近内囊的苍白球内进行定位，定位之后用微量进样器缓慢注入0.5 μl胶原酶灭菌的0.9%氯化钠溶液2.5 μl，注射时间约2 min，留针约5 min，退针约0.5 mm，再留针约5 min，慢慢拔出针头，骨蜡封闭骨窗，皮肤缝合。造模成功的评价方法：对手术后清醒的造模SD大鼠，按照Zeal Longa 5级评分法判断脑出血模型制备是否成功。0分：无神经系统功能缺失症状出现，一切活动均正常；1分：SD大鼠在接受提尾悬空动作时，脑出血对侧前肢不自主的出现屈曲、抬高等动作，并且伴随着肩内收、肘关节伸直等表现，此时为轻度局灶性神经功能缺陷症状；2分：SD大鼠在具有轻度局灶性神经功能缺陷症状表现的同时，又伴随行走时向脑出血对侧转圈现象，称为中度局灶性神经功能缺陷症状；3分：SD大鼠在行走时其身体会向脑出血对侧倾倒，称为重度局灶性神经功能缺陷症状；4分：行走极度困难，甚至无意识。1～3分为脑出血模型造模成功大鼠。假手术组只在相应位置钻孔，插入注射器，留针10 min，不注射任何物质。造模后第2天起，补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组灌胃补阳还五汤，药量分别为13.2、26.5、53.0 g·kg-1·d-1，连续给药14 d，假手术组及模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.4PI3K、AKT表达水平检测采用随机数字表法每组选取6只大鼠注射3.5 mg/kg水合氯醛溶液麻醉，4%多聚甲醛溶液左心室插管灌注固定，取视交叉至大脑裂之间脑组织，常规石蜡包埋。Leica切片机连续5 μm冠状切片。常规脱蜡、梯度乙醇浸水，枸橼酸盐缓冲液修复抗原，山羊血清封闭，脑切片上分别滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多克隆抗体，4 ℃静置12 h，二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。利用磷酸盐缓冲液(PBS)作阴性对照。利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统计算400倍镜下血肿灶周围3个视野的阳性细胞数，取平均值。

1.5AQP4表达水平检测采用随机数字表法每组选取6只大鼠断头取血肿周围脑组织，0.01 mol/L PBS洗净血液，加入裂解液和10 μl苯甲基硫酰氟(PMSF)(10 g/L)，4 ℃匀浆，以10 000 r/min离心10 min(离心半径8 cm)，取上清液，BCA法蛋白定量。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜、封闭后，滴加AQP4一抗(1∶200)，4 ℃冰箱过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 000)37 ℃温箱孵育1 h，荧光发光液发光，X线胶片曝光显影后，利用Quantity One软件对X线胶片上AQP4表达的灰度值进行分析。

1.6脑组织含水量检测采用随机数字表法每组选取6只大鼠断头、取出血侧脑组织于分析天平称湿重，再置于100 ℃真空干燥箱烘干24 h，再称干重。脑组织含水量(%)=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%。

1.7血-脑脊液屏障通透性检测每组剩余6只大鼠乙醚麻醉，由尾静脉注入4 ml/kg 2%伊文思蓝(EB)溶液。参照文献[5]的方法计算脑组织EB含量。EB含量升高，表明血-脑脊液屏障通透性增强。

2　结果

2.1各组PI3K、AKT表达水平比较PI3K和AKT阳性表达呈棕褐色颗粒样物质，均位于细胞的胞质(见图1、2，本文图1、2彩图详见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组PI3K、AKT表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组PI3K表达水平高于假手术组，补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组PI3K表达水平高于模型组，补阳还五汤高剂量组PI3K表达水平高于补阳还五汤低剂量组和补阳还五汤中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AKT表达水平高于假手术组，补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AKT表达水平均分别高于模型组和补阳还五汤低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2各组AQP4表达水平比较假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AQP4表达水平分别为(0.12±0.01)%、(0.22±0.01)%、(0.27±0.02)%、(0.27±0.02)%、(0.28±0.02)%。5组AQP4表达水平比较，差异有统计学意义(F=95.79，P<0.001)；其中模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AQP4表达水平高于假手术组，补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组AQP4表达水平高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

Table 1Comparison of the expression of PI3K and AKT among five groups

组别只数PI3KAKT假手术组65.8±0.95.5±1.1模型组68.8±1.4a8.3±1.9补阳还五汤低剂量组611.2±1.4ab9.9±2.4a补阳还五汤中剂量组612.6±1.8ab13.2±2.6abc补阳还五汤高剂量组15.8±2.1abcd15.8±2.7abcF值31.3021.10P值<0.001<0.001

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与补阳还五汤低剂量组比较，cP<0.05；与补阳还五汤中剂量组比较，dP<0.05；PI3K=磷酸化肌醇磷脂3激酶，AKT=蛋白激酶B

图1　各组PI3K表达的免疫组织化学结果(SABC法，×400)

图2　各组AKT表达的免疫组织化学结果(SABC法，×400)

2.3各组脑组织含水量比较假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组大鼠脑组织含水量分别为(60.0±2.6)%、(78.9±5.4)%、(73.7±4.5)%、(72.7±4.5)%、(69.9±3.7)%。5组脑组织含水量比较，差异有统计学意义(F=16.21，P<0.001)；其中模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组脑组织含水量高于假手术组，补阳还五汤高剂量组脑组织含水量低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组脑组织EB含量比较假手术组、模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组大鼠脑组织EB含量分别为(1.4±1.0)、(17.0±3.1)、(14.2±1.9)、(12.2±1.6)、(11.7±1.2) μg/g。5组脑组织EB含量比较，差异有统计学意义(F=60.05，P<0.001)；其中模型组、补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组脑组织EB含量高于假手术组，补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组脑组织EB含量低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3　讨论

PI3K/AKT是一种促细胞存活的信号转导通路，参与脑缺血的病理过程，与神经元的存活密切相关[6]。脑出血后，机体可以释放出一些能够将具有酪氨酸激酶活性的受体激活的物质，如神经细胞生长因子、整合素等，受体磷酸化后会特异性结合PI3K的调节亚基，从而将PI3K激活；同时兼备脂类激酶活性与蛋白激酶活性的PI3K激活后可以使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[7]。PI3K与其下游效应分子AKT的PH结构域结合，使AKT由抑制状态变为激活状态，进而通过直接将其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者间接改变编码凋亡相关蛋白的基因表达水平来实现脑保护作用[6，8]。总之，PI3K/AKT信号转导通路激活后，能够作用于Bcl-2、BAX、Caspase-3、核因子(NF)-κB等下游凋亡靶蛋白，通过激活或抑制其表达来发挥生物学效应。本研究结果显示，不同剂量补阳还五汤组PI3K、AKT表达水平高于模型组，与蔡俊等[9]在补阳还五汤对脑缺血大鼠的影响研究中所得结果一致，提示脑出血中补阳还五汤发挥抑制脑水肿的脑保护效果与PI3K/AKT信号转导通路的激活密不可分。

AQP4在星形胶质细胞足突形成的胶质界膜和血管周围星形胶质细胞表面以及渗透压感受区有丰富的特异性表达，是胶质细胞与血管之间水的调节和转运的结构基础[3]，在维持大脑水平衡中发挥至关重要的作用。也就是说，AQP4只有极性表达在星形胶质细胞终足膜上时，才能够正确发挥其调控水转运的功能[10]。脑出血时脑组织中存在AQP4极性表达缺失，促进出血性脑水肿的发生[3]。而AQP4的水通透性可以被多种蛋白可逆磷酸化调控[11]。以往研究发现，PI3K/AKT信号转导通路可以调节AQP3的表达，而AQP3与AQP4同属于AQPs亚族，两者结构有许多相似之处，且两者均在脑组织内高度表达[12-13]，由此推测，PI3K/AKT信号转导通路可以通过调节AQP4的表达而在脑出血所致的脑水肿中发挥作用。本研究发现，补阳还五汤低剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤高剂量组大鼠AQP4表达水平明显增强，脑组织含水量降低，血-脑脊液屏障通透性降低，提示补阳还五汤通过对PI3K/AKT信号转导通路的激活实现了对AQP4表达的调控，从而实现减轻脑水肿，降低血-脑脊液屏障通透性，保护脑组织的作用。

因此，补阳还五汤对脑出血具有较好的治疗作用，其机制可能与其激活PI3K/AKT信号转导通路，并通过该通路调控脑组织密切相关蛋白AQP4，使其发生极性表达，进而降低血-脑脊液屏障通透性，从而实现减轻脑组织水肿，保护神经功能的作用。

作者贡献：刘绍晨、吴晓光、李义学进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；刘绍晨、杨岚、李义学、仇志富进行实验实施、评估、资料收集；吴晓光进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

Effects of Buyanghuanwu Decoction on Aquaporin 4 Expression and the Permeability of the Blood Brain Barrier in Cerebral Hemorrhage Rats

LIUShao-chen，WUXiao-guang，YANGLan，etal.

DepartmentofPathology，ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China

ObjectiveTo explore the effects of Buyanghuanwu decoction on aquaporin 4(AQP4)expression and the permeability of the blood brain barrier in cerebral hemorrhage rats.MethodsFrom March 2014 to November 2015，SPF level adult male SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups，24 in each group.Model group and Buyanghuanwu decoction groups prepared models of cerebral hemorrhage.Since two days after modeling，Buyanghuanwu decoction low，medium，and high dose groups were given Buyanghuanwu decoction by gastric perfusion，the dose was 13.2 g·kg-1·d-1，26.5 g·kg-1·d-1and 53.0 g·kg-1·d-1respectively，continuously for 14 days，and sham operation group and model group were given the equal volume of the corresponding 0.9% sodium chloride solution.The expression of phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)and protein kinase B(AKT)was detected by immunohistochemistry.The expression of AQP4 was detected by immunofluorescence labeling method.Content of water in brain was detected by wet and dry weight method，and formamide method was used to detect the blood-brain barrier permeability.ResultsSham operation group，model group，Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were significantly different in the expression of PI3K and AKT(P<0.05)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were higher than model group in the expression of PI3K；Buyanghuanwu decoction medium and high dose groups were higher than model group in the expression of AKT(P<0.05).The 5 groups were significantly different in the expression of AQP4(F=95.79，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were higher than model group in the expression of AQP4(P<0.05).The 5 groups were significantly different in brain water content(F=16.21，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction high dose group was lower than model group in brain water content(P<0.05).The 5 groups were significantly different in the EB content of cerebral tissue(F=60.05，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were lower than model group in EB content of cerebral tissue(P<0.05).ConclusionBuyanghuanwu decoction can alleviate encephaledema induced by cerebral hemorrhage，and its mechanism may be related with the activation of PI3K/AKT singal，the regulation of the extreme expression of AQP4，and the reduction of blood-brain barrier permeability.

Cerebral hemorrhage；Buyanghuanwu decoction；Brain edema；Aquaporin 4；Blood-brain barrier

河北省高等学校重点学科病理学与病理生理学资助项目(2013)；河北省中医药抗痴呆重点研究室资助项目(2014)；承德医学院校级重点资助项目(201607)

067000 河北省承德市，承德医学院病理学教研室(刘绍晨)；承德医学院基础医学研究所 河北省中医药抗痴呆重点研究室(吴晓光，杨岚，仇志富)；承德医学院附属医院(李义学)

吴晓光，067000 河北省承德市，承德医学院基础医学研究所 河北省中医药抗痴呆重点研究室；E-mail：ewxg@qq.com

R 743.34 R 742

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.21.013

2016-01-20；

2016-05-19)