氯丙嗪对肝癌HepG2细胞的抑制作用*

曹胜男，邱　敏，杨世俊，江　帆，韦先明，徐东东，张　伟，王　娱，宁志丰，刘复兴

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)



氯丙嗪对肝癌HepG2细胞的抑制作用*

曹胜男，邱敏，杨世俊，江帆，韦先明，徐东东，张伟，王娱，宁志丰，刘复兴**

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)

摘要：目的 探索抗精神病药物氯丙嗪对HepG2细胞的抑制作用。方法 常规培养HepG2细胞，设置不同梯度的氯丙嗪药物浓度，从生长能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力来研究氯丙嗪对HepG2细胞的药理作用。结果 不同药物浓度下，HepG2细胞的生长能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力随着药物浓度的增高呈递减趋势。结论 氯丙嗪对肝癌HepG2细胞有抑制作用。

关键词：氯丙嗪；肝癌；HepG2细胞

肝癌是是世界上最常见的肿瘤之一，也是导致肿瘤相关死亡的主要原因之一[1]。在我国，肝癌病死率占恶性肿瘤第二，且发病率呈逐渐上升趋势[2]。此外，肝癌的恶性程度很高，肝癌患者的生存率也很低，所以当前应为肝癌的治疗寻找新的手段。我们主要探索抗精神病药物氯丙嗪对HepG2细胞的药理作用。

1材料与方法

1.1实验材料人肝癌细胞HepG2细胞系来自于武汉大学中国培养物典藏中心。改良RPMI1640液体培养基( HyClone公司)，胎牛血清(FBS，HyClone公司),胰酶为Gibco公司产品，氯丙嗪(常州康普药业有限公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，6孔板(costar 公司)，96孔板(costar公司产品)，100×双抗、结晶紫购于天津索罗门生物科技公司，其他试剂为生化分析纯。

1.2细胞培养肝癌HepG2细胞常规培养于含10%FBS和100U/mL 青霉素及100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞密度达到80%左右时予以传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3MTT实验取对数生长期的细胞，计数，以5000个/孔接种于96孔板内，100μL/孔，分为6组，每组6个平行复孔，常规培养24h后，加含氯丙嗪的完全培养液(浓度0、5、10、20、40、80μM)，药物作用72h后，每孔加MTT(5g/L)20μL,继续孵育培养4h后，弃上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，震荡10min，结晶溶解充分，酶标仪490nm处测定OD值。

1.4平板克隆形成实验取对数生长期的细胞，计数，以每孔200个细胞接种于6孔板内，设定药物浓度(0、5、10、20、40μM)，常规培养14d，每3d换液一次。弃原培养液，PBS洗3次，甲醇常温固定15min，0.1%结晶紫染色20min，流水清洗，晾干。显微镜下计数(含细胞50个以上克隆为阳性克隆)，计算克隆形成率(克隆形成率=阳性克隆数/种板细胞数×100%)。

1.5迁移与侵袭实验用RPMI1640无血清培养基1∶5稀释matrigel胶包被小室上室，每孔60μL，37℃ 30min后，无血清培养基50μL/孔水化基底膜，37℃ 30min。胰酶消化细胞，离心，PBS洗2～3次，无血清培养基重悬、混匀。细胞计数，调整细胞密度为5×105个/mL，设置药物浓度梯度，上室加细胞100μL/孔，下室加入500μL 10%完全培养基，培养24～48h,弃培养基，用棉签小心擦去上室基质胶，甲醇固定15min，PBS洗3次，0.1%结晶紫染色20min，PBS洗3次，显微镜下计数穿过微孔膜细胞，每个样本10个视野计数。迁移实验同上法操作，不需包被上室。

2结果

2.1生长能力随着药物浓度的递增，HepG2细胞的生长能力呈递减趋势，见图1。

图1　不同氯丙嗪药物浓度下的HepG2生存能力

2.2平板克隆形成能力随着药物浓度的增高，HepG2细胞的克隆形成能力减弱，不同浓度(0、5、10、20、40μM)氯丙嗪所对应的HepG2细胞的克隆形成率分别为(61.67±1.25)%、(56.67±0.62)%、(47.30±0.47)%、(2.50±0.41)%、(0.67±0.23)%，组间差异有统计学意义(P<0.05)，见图2(封二)。

2.3迁移和侵袭能力随着药物浓度的增大，细胞的迁移和侵袭能力都降低(P<0.05)，见图3(封二)、图4(封二)、表1。

表1　各组迁移和侵袭能力比较(个,

注：各浓度组间两两比较，P<0.05

3讨论

目前已用于肿瘤研究的抗精神病药是甲硫哒嗪，甲硫哒嗪属于吩噻嗪类药物，它是一种强效的抗焦虑和抗精神病药物，在晚期癌症中，已用于治疗癌症相关的出汗[3]和抑郁[4]。此外，甲硫哒嗪具有抗肿瘤作用，具体表现是抗增殖和促进癌细胞凋亡，例如，它能促进宫颈癌和子宫内膜癌、卵巢癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤、白血病、乳腺癌[5-7]等细胞的凋亡。而氯丙嗪与甲硫哒嗪同属吩噻嗪抗精神病药物，具有相同的药理作用，还具有相似的化学结构，故我们选择氯丙嗪来研究它对肝癌细胞的作用。本实验中，采用MTT实验、平板克隆形成实验、肿瘤迁移和侵袭实验检测氯丙嗪对HepG2细胞的药理作用。结果显示，在不同药物浓度梯度下，肝癌细胞的生长能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均呈现递减趋势，尤其在80μmol/L时，肝癌细胞HepG2丧失生长能力、克隆形成能力，但是似乎没有完全抑制迁移和侵袭能力，提示氯丙嗪对肝癌HepG2的增殖生长抑制能力强于对它的迁移和侵袭能力。Transwell迁移和侵袭能力在一定程度上反映了恶性肿瘤的转移能力，说明氯丙嗪抑制肝癌转移的作用弱于抑制增殖的作用，但是这只是个初步研究，还不能得出最终结论，由于肿瘤的增殖加速早于转移，提示氯丙嗪更可能在肝癌早期阶段起作用。按照《细胞培养》试验药物浓度(μg/mL)=(mg 平均体表面积)/平均体重*100/6[8]来计算，中国成人男性平均身高167.1cm、体重66.2kg，女性成人平均升高155.8cm、体重57.3kg，氯丙嗪日阈剂量600mg,细胞试验药物浓度最大应为26.8μg/mL。而在本实验中，氯丙嗪药物浓度为20μmol/L(14.2μg/mL)时，对肝癌细胞的作用已经非常明显，而在40μmol/L(28.4μg/mL)时，作用效果已非常显著。此外，在本实验中所用氯丙嗪为片剂粉碎溶解过滤所得，其实际药物浓度应比理论药物浓度偏低。这更说明了氯丙嗪可能可用于肝癌的治疗。

目前，甲硫哒嗪抑制肿瘤机制已有探究，例如Sokbom 等[9]通过实验等证明在宫颈癌和子宫内膜癌中，甲硫哒嗪能有效抑制(磷脂酰激醇3激酶)PI3-K-(蛋白激酶B)Akt-mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)细胞通路，PI3-K及Akt通过使mTOR磷酸化而使各种癌症细胞凋亡,mTOR磷酸化，激活p70S6K,通过促使细胞周期进展从而促进蛋白质合成、肿瘤生长及血管生成。Mi Sun等[10]也发现在卵巢癌中，甲硫哒嗪抑制卵巢癌的生长也与PI3-K-Akt-mTOR通路有关。此外，Eleftherios等[11]研究证实多巴胺受体在肿瘤干细胞中高表达，而甲硫哒嗪能有选择地作用于肿瘤干细胞而对人类正常干细胞无影响，原因在于甲硫哒嗪能作用于多巴胺受体，抑制多巴胺受体的表达，多巴胺受体表达下调，肿瘤的生长受到抑制故而发挥抗肿瘤作用。Daniel等[12]在弥散性巨型B细胞淋巴瘤实验中发现吩噻嗪类化合物在抑制抗凋亡基因NF-κB的同时，还能选择性作用于弥散性巨型B细胞淋巴瘤细胞的MALT1(黏膜相关淋巴瘤易位基因)上，而MALT1是弥散性巨型B细胞淋巴瘤发生发展所必需的基因，故吩噻嗪类化合物能抑制肿瘤细胞的生长与发展。因此，本实验下一步将对氯丙嗪抑制肝癌的机制进行具体探究。

参考文献：

[1]Wong R,Frenette C.Updates in the Management of hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterol Hepatol(NY),2011,7(1)：16

[2]张跃伟.微创介入治疗肝癌对机体免疫功能影响的研究现状与展望[J].实用肝脏病杂志，2014，17(3)：231

[3]Zhukovsky DS.Fever and sweats in the patient with advanced cancer[J].Hematol Oncol Clin North Am，2002,16(3):579

[4]Ly KL，Chidgey J，Addington-Hall J，et al.Depression in palliative care：a systematic review[J].Palliat Med，2002,16:279

[5]Min KJ,Seo BR,Bae YC,et al.Antipsychotic agent thioridazine sensitizes renal carcinoma Caki cells to TRAIL-induced apoptosis through reactive oxygen species-mediated inhibition of Akt signaling and downregulation of Mcl-1 and c-FLIP(L)[J].Cell Death Dis,2014,5:e1063

[6]Rho SB，Kim BR，Kang S.A gene signature-based approach identifies thioridazine as an inhibitor of phosphatidylinositol-3'-kinase (PI3K)/AKT pathway in ovarian cancer cells[J].Gynecol Oncol,2011,120:121

[7]Tao YIN，Sisi HE，Guobo SHEN,et al.Dopamine receptor antagonist thioridazine inhibits tumor growth in a murine breast cancer model[J].Mol Med Rep,2015,12(3)：4103

[8]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].世界图书出版公司，2007：165

[9]Sokbom K,Seung MD,Boh-Ram K,et al.Thioridazine induces apoptosis by targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in cervical and endometrial cancer cells[J].Apoptosis,2012,17(9):989

[10]Mi SP,Seung MD,Boh-Ram K,et al.Thioridazine inhibits angiogenesis and tumor growth by targeting the VEGFR-2/PI3K/mTOR pathway in ovarian cancer xenografts[J].Oncotarget,2014,5(13):4929

[11]Eleftherios S，Ruth MR,Sarah L,et al.Identification of Drugs Including a Dopamine Receptor Antagonist that Selectively Target Cancer Stem Cells[J].Cell,2012,146(6):1284

[12]Daniel N，Stefani S，Michelle V,et al.Pharmacologic Inhibition of MALT1 Protease by Phenothiazines as a Therapeutic Approach for the Treatment of Aggressive ABC-DLBCL[J].Cancer cell,2012,22(6):825

Inhibitory Effect of Chlorpromazine on HepG2 Cells

CAO Sheng-nan，QIU Min，LIU Fu-xing，et al

(SchoolofBasicMedicine,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To explore the inhibitory effect of chlorpromazine on liver cancer cell line HepG2. Methods HepG2 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum,100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin.Different concentrations of chlorpromazine were set to test the influence on the ability of proliferation,colony formation，mobility and invasion of HepG2.Results Chlorpromazine could inhibit the proliferation of HepG2,colony formation and the ability ofmobility and invasion in a concentration-dependent manner.Conclusion Chlorpromazine has inhibitory effect on liver cancer cell line HepG2.

KEY WORDS：Chlorpromazine;Liver cancer;HepG2 cell

*基金项目：湖北科技学院省级大学生创新创业项目(201510927008)

中图分类号：R735.7

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)03-0185-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0185

(收稿日期：2016-01-06)

**通讯作者，E-mail：liufx6505@126.com