青蒿素减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究

沈秀珍，王　凌，方毅华

(赤壁市人民医院心内科，湖北 赤壁 437300)



青蒿素减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究

沈秀珍，王凌，方毅华

(赤壁市人民医院心内科，湖北 赤壁 437300)

摘要：目的 探讨青蒿素是否可以通过调节自噬减轻心肌缺血再灌注(I/R)损伤以及可能的机制。方法 采用大鼠心肌I/R模型(缺血30min，再灌注4h)，雄性SD大鼠30只随机分为3组：假手术组(SO组，n=10)、缺血再灌注组(I/R组，n=10)和青蒿素治疗组(A+I/R组，n=10，Arteannuin:25mg/kg，Tid，造模前1d灌胃)。检测心肌损伤标记物肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白I(cTnI)；检测氧化应激水平(丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；检测自噬蛋白beclin-1和LC3水平。结果 与SO组比较，I/R组可诱导心肌损伤标记物，氧化应激水平的增加和自噬的过度激活；与I/R组比较，青蒿素可显著的降低心肌损伤标记物的表达、氧化应激水平和自噬的过度激活。结论 ①青蒿素可以通过抑制过度自噬减轻心肌I/R损伤；②青蒿素可能通过抑制氧化应激，抑制再灌注阶段自噬过度激活。

关键词：青蒿素；自噬；氧化应激；心肌缺血；再灌注损伤

自噬是细胞在应激或不良状态下的一种自我保护过程，可以清除降解的蛋白质和损伤的细胞器。通常认为，自噬是细胞稳态的维护者，然而，过度的自噬也可以引起细胞死亡，称为自噬性程序性细胞死亡(程序性死亡共三种，另外两种为凋亡和坏死)，这说明自噬对细胞的影响是多样的、复杂的。前期的研究证实[1，2]，自噬是心肌缺血再灌注损伤的重要机制之一，它在损伤的起始和进展过程中都发挥了重要作用。

青蒿素是青蒿的活性成分，因其100%的抗疟性而受到世界的关注。近年的研究发现[3，4]，青蒿素对多种疾病都有明显的抗炎和抗氧化应激的作用，包括心梗和心肌I/R损伤。炎症和氧化应激是导致自噬过度激活的重要因素[5]，但青蒿素是否可以通过调节自噬减轻心肌I/R损伤，目前尚无研究，为验证上述假设我们进行了下述研究。

1材料与方法

1.1动物准备与分组30只成年雄性SD大鼠，购于武汉大学动物实验中心。于恒温、恒湿、明/暗交替(12h)的环境喂养48h。

大鼠缺血再灌注模型：2%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg，ip)后，仰卧固定于鼠板，气管插管(频率：70bpm，吸呼比：1∶1.5，潮气量：3～4mL/100g)。胸骨左缘切口，暴露心脏，破心包膜；于左心耳下2～3mm处将前降支与一个中间带有凹槽的空心乳胶管一起结扎，结扎线下心肌变苍白表明缺血成功。缺血30min后，沿乳胶管凹槽剪断结扎线再灌注4h。再灌注4h后，2%戊巴比妥钠麻醉(20mg/kg，ip)，颈静脉采血2mL，迅速剪下心脏，剪除多余部分留取心梗区(白色)和缺血区(白色附近5mm)用于检测。30只大鼠随机分为3组：假手术组(SO，n=10)：仅插管、开胸、LAD下穿线但不结扎；缺血再灌注组(I/R，n=10)：按照上面所述造模，缺血30min，再灌注4h；青蒿素治疗组(A+I/R，n=10)：造模前1d青蒿素灌胃(25mg/kg，Tid)，造模同I/R组。

1.2检测指标和方法

(1)分光光度法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白I(cTnI)，通过心肌损伤标记物(LDH、CK、cTnI)的表达水平反应心肌损伤情况。静脉采血后静置10min，待血液凝固后离心(3000r/min×15min)，取血清。选用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照说明操作检测LDH和CK。

(2)检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，通过检测MDA和SOD评价心肌组织氧自由基含量和脂质超氧化水平。检测方法如前所述，采用南京建成生物工程研究所的MDA和SOD试剂盒，严格按照说明操作。

(3)western blot法检测LC3和beclin-1，组织匀浆在PAGE胶中电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，1抗孵育过夜，包括LC3(1∶500稀释，sigma)，beclin-1(1∶500稀释，Abcanm)和β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)。在相应的二抗孵育后，ECL显色，以其与β-actin的比值表示其相对表达量。

2结果

2.1血清LDH、CK和cTnI结果与SO组比较，I/R组中LDH、CK和cTnI水平明显升高(P均<0.05)；A+I/R组中CK和cTnI水平明显增高(P均<0.05)，LDH有增高趋势，但未达统计学差异(P>0.05)。与I/R组比较，A+I/R组中LDH、CK和cTnI水平明显降低(P均<0.05)。见表1。

表1　青蒿素对心肌损伤标记物的影响±s)

与SO组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

2.2心肌组织MDA和SOD水平结果见表2。与SO组比较，I/R组中MDA表达明显升高，而SOD表达明显降低(P均<0.05)。与I/R组比较，A+I/R组中MDA表达明显下降，而SOD表达明显升高(P均<0.05)。

2.3心肌组织LC3与beclin-1水平结果见表2。与SO组比较，I/R组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明显升高(P均<0.05)。与I/R组比较，A+I/R组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明显降低(P均<0.05)。

表2　青蒿素对氧化应激和自噬的影响±s)

与SO组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

3讨论

青蒿素是由我国专家最先从青蒿中提取的活性成分，因其100%的抗疟有效性而受到世界的关注。虽然对青蒿素抗炎作用的研究由来已久，但青蒿素与心血管疾病关系的研究却很少，且主要集中在心律失常[4，6]。Gu等[4，6]发现青蒿素可以通过抑制心梗后炎症反应，减轻心脏的自主神经重构和心脏电生理基质的损伤。Sun等[3]发现，在离体缺氧复氧模型中，青蒿素可以明显抑制氧自由基生成，增加脂质超氧化。本研究用在体I/R模型进一步印证了上述结论，但本研究首次发现，青蒿素可以明显降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和beclin-1表达，及抑制过度自噬减轻心肌缺血再灌注损伤。

研究表明，自噬是心肌I/R的重要病理生理机制之一[1，2]。I/R诱导的ATP耗竭、氧化应激、内质网应激和蛋白质降解等均会增强自噬[5]。自噬对细胞的影响是多面性的，适度的自噬可以帮助细胞清除降解的蛋白质和损伤的细胞器，具有保护作用，但过度激活自噬却可以导致细胞程序性死亡。目前自噬对心肌I/R的作用尚无定论，通常认为，在心肌缺血阶段，自噬被适度激活，表现为心肌保护作用，但在再灌注阶段，自噬被过度激活，表现为加重心肌损伤的作用[1，2]。Matsui等[1，2]证实，在心肌再灌注阶段beclin-1水平明显升高bcl-2明显降低，标志自噬被过度激活，进而诱发细胞程序性死亡。Beclin-1是一种关键的自噬蛋白，可以调节自噬小体的形成和进展。在再灌注阶段，beclin-1是诱导自噬过度激活的关键蛋白，研究证实，通过siRNA抑制beclin-1表达可以抑制自噬的过度激活，减轻I/R损伤[7]。众所周知，在再灌注阶段，氧自由基的过度生成而非能量耗竭是诱导细胞自噬的主要因素。Hariharan等[8]证实，氧自由基的生成伴随beclin-1的高表达，给予抗氧化剂处理可明显降低beclin-1的表达，这说明，活性氧是通过调节beclin-1的表达调节再灌注阶段的心肌细胞自噬。另外，LC3为自噬相关蛋白，IL3-Ⅱ为脂质化的活性状态，IL3-Ⅰ为未脂质化的非激活状态，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值可以反应自噬的激活状态。研究发现，活性氧可通过抑制ATG4的激活，促进LC3脂质化激活自噬[9]。本研究发现，青蒿素可以明显抑制氧化应激(降低MDA水平，升高SOD水平)，抑制过度自噬(降低beclin-1水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值)，因此我们推测，青蒿素可以通过抑制氧化应激，抑制心肌I/R中自噬过度激活。

综上所述，青蒿素可以通过抑制过度自噬减轻心肌I/R损伤，其可能通过抑制氧化应激，抑制再灌注阶段自噬过度激活。

参考文献：

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[6]Gu Y，Wu G，Wang X，et al.Artemisinin prevents electric remodeling following myocardial infarction possibly by upregulating the expression of connexin 43[J].Molecular Medicine Reports，2014，10(4):1851

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[8]Hariharan N，Zhai P，Sadoshima J.Oxidative stress stimulates autophagic flux during ischemia/reperfusion[J].Antioxid Redox Signal,2011，14(11):2179

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Artemisinin Alleviates Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury via Autophagy Regulation

SHEN Xiu-zhen，WANG Ling，FANG Yi-huang

(DepartmentofCardiology，People'HospitalofChibi，ChibiHubei437300，China)

ABSTRACT：Objective To investigate the protective effect of artemisinin on myocardial ischemia and reperfusion(I/R) injury and the possible mechanism. Methods Rat I/R model was established by ligation of left anterior descending coronary artery for30min，followed by reperfusion for 4h.30 rats were divided into three groups: sham-operated group (SO)，ischemia and reperfusion group (I/R) and artemisinin treatment group (A+I/R)，10 rats in each group.Cardiac injury markers (serum creatine (CK)，lactate dehydrogenase (LDH)，and cTnI)，oxidative stress indexes (malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) and autophagy markers (beclin-1 and LC3) were detected.Results Compared with SO group，the levels of CK，LDH，cTnI MDA and the activity of SOD were significantly increased；autophagy was excessively activated in I/R group.Compared with I/R group，artemisinin significantly decreased the contents of CK，LDH,cTnI and MDA and increased the activity of SOD in myocardial tissue,decreased beclin-1 level and LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio，suppressed excessive activation of autophagy .Conclusion Artemisinin can protect against myocardial I/R injury via suppressing oxidative stress and excessiveof activation autophagy.

KEY WORDS：Artemisinin；Autophagy;Oxidative stress;Myocardial ischemia；Reperfusion injury

中图分类号：R-33

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)03-0191-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0191

(收稿日期：2016-01-22)