Krupple样因子6调控诱导型一氧化氮合酶介导铜绿假单胞菌感染小鼠肺组织细胞凋亡的研究

喻志芳，韩 彬，柴文戍



·论著·

Krupple样因子6调控诱导型一氧化氮合酶介导铜绿假单胞菌感染小鼠肺组织细胞凋亡的研究

喻志芳，韩 彬，柴文戍

121001辽宁省锦州市，锦州医科大学附属第一医院呼吸内科

【摘要】目的通过研究Krupple样因子6(KLF6)在铜绿假单胞菌感染肺组织中表达水平的变化，探讨KLF6调控诱导型一氧化氮合酶(iNOS)介导铜绿假单胞菌感染小鼠肺组织细胞凋亡的机制。方法于2014年10—12月，30只小鼠随机分为对照组和低感染组，每组15只，低感染组注射铜绿假单胞菌1.0×107 CFU制作动物模型，感染后3、9、24 h，分别随机取各组5只小鼠留取标本。另10只小鼠随机分为中感染组和高感染组，每组5只，分别注射铜绿假单胞菌5.0×107、1.0×108 CFU，均在感染后9 h留取标本。在各时间点处死动物后无菌分离肺组织,左肺结扎后测定湿干重之比。采用TUNEL法检测肺组织细胞凋亡指数，采用硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)水平,化学比色法测定iNOS活性，采用Western blotting法检测肺组织KLF6水平。结果光镜下可见低感染组小鼠肺组织大量炎性细胞浸润,肺泡隔增厚，肺泡壁结构破坏，局部有肺泡膨胀不全或肺泡塌陷,并扩散到肺间质内，24 h时炎症改变最为严重。3 h时,对照组和低感染组肺组织湿干重之比比较，差异无统计学意义(P>0.05)；9、24 h时，低感染组肺组织湿干重之比大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。低感染组不同时间肺组织凋亡指数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量铜绿假单胞菌感染9 h后肺组织凋亡指数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。3、9、24 h时，低感染组肺组织NO水平、iNOS活性均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量铜绿假单胞菌感染9 h后肺组织NO水平、iNOS活性比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。低感染组不同时间肺组织KLF6表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量铜绿假单胞菌感染9 h后肺组织KLF6表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论铜绿假单胞菌感染能诱导KLF6的表达，并有可能通过iNOS调控介导细胞凋亡。

【关键词】铜绿假单胞菌；Krupple 样因子6；一氧化氮合酶；细胞凋亡

喻志芳，韩彬，柴文戍.Krupple样因子6调控诱导型一氧化氮合酶介导铜绿假单胞菌感染小鼠肺组织细胞凋亡的研究[J].中国全科医学，2016，19(20)：2435-2439.[www.chinagp.net]

YU Z F,HAN B,CHAI W S.KLF6 and iNOS regulated apoptosis during pseudomonas aeruginosa lung infection in mice[J].Chinese General Practice，2016，19(20)：2435-2439.

铜绿假单胞菌是自然环境中广泛存在的革兰阴性杆菌，可导致免疫功能低下者急性感染，有肺基础疾病者慢性终生感染[1]。组织损伤时，一氧化氮(NO)作为细胞因子可使靶细胞凋亡，加强局部炎性反应，而诱导型一氧化氮则在感染后产生[2]。虽然感染铜绿假单胞菌时，NO是加重肺疾病的关键因素，但其在感染过程中诱导凋亡的机制尚未明确。已有研究表明，Krupple样因子6(KLF6)在炎性反应的基因表达调控中发挥重要作用[3]，但其与铜绿假单胞菌所致组织细胞凋亡相关性研究较少。本文探讨感染铜绿假单胞菌时KLF6的作用机制，为临床治疗提供新的方法。

1材料与方法

1.1材料与试剂实验动物来源于锦州医科大学实验中心SPF级昆明小鼠〔许可批号：SCXK(辽)2014-0004〕；铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853由锦州医科大学附属第一医院检验中心赠送；TUNEL试剂盒购自Roche公司；KLF6(R-173)购自美国Santa cruz biotechnology,货号SC-7158；NO试剂盒(硝酸还原酶法)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)测试盒购自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株配制于2014年10—12月，参考文献[4]配制铜绿假单胞菌菌株，加1.0 ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细菌,用分光光度比色法测定菌液的浓度，悬浮于无菌0.9%氯化钠溶液调整至1.0×108CFU/ml备用。

1.2.2动物模型40只昆明小鼠，体质量20～30 g，雌雄各半，其中30只随机分为对照组和低感染组，每组15只，在感染后3 、9 、24 h，分别随机取各组5只留取标本。对照组小鼠不做处理。低感染组小鼠腹腔内注射体积分数为10%的水合氯醛0.6～1.0 ml麻醉，参考文献[5]制作铜绿假单胞菌感染模型，每只小鼠注射铜绿假单胞菌1.0×107CFU。剩余10只随机分为中感染组和高感染组，每组5只，分别注射铜绿假单胞菌5.0×107、1.0×108CFU，均在感染后9 h留取标本。在各时间点处死小鼠后无菌分离肺组织,左肺结扎后测定湿干重之比，结扎的右上叶肺组织用4%多聚甲醛固定液固定,行石蜡包埋、切片，剩余的部分右肺组织于-80 ℃储存。

1.2.3肺组织湿干重之比的测定处死小鼠取肺时将左肺称重，记为湿重。70 ℃烤箱中烘烤24 h后所称重量记为干重，计算湿干重之比。

1.2.4肺组织病理学检测将由4%多聚甲醛固定液固定后的肺组织行石蜡包埋和切片,随机抽取1张切片行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肺组织的形态学改变,在400倍视野下连续观察10 个不同视野。

1.2.5肺组织细胞凋亡检测采用TUNEL法进行检测，操作均按照试剂盒说明书进行。凋亡细胞胞核呈棕褐色颗粒状，在400倍视野下，每张切片观察10个视野，以凋亡细胞数量占同一视野中的细胞总数的百分比表示为凋亡指数。

1.2.6肺组织NO水平及iNOS活性的测定取出存放于-80 ℃冻存的肺组织，在4 ℃的0.9%氯化钠溶液中漂洗,滤纸拭干,分析天平准确称取重量后，加入9倍的0.9%氯化钠溶液,制成质量分数为10%的组织匀浆，4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min(离心半径为6 cm),取上清液按试剂盒说明书操作，用硝酸还原酶法测定NO水平,用化学比色法测定iNOS活性。

1.2.7肺组织KLF6表达水平的测定每0.01～0.02 g肺组织加入100～200 μl RIPA裂解液和1～2 ml PMSF，用剪刀剪碎肺组织，冰浴上超声10 s，停20 s，反复20次，直至组织均匀，冰上静置20 min，4 ℃条件下以12 000 r/min离心15 min(离心半径为6 cm)，取上清液后经BCA法定量。取40 g蛋白上样，完成一抗、二抗孵育后，加ECL显色剂显色，图像扫描分析条带,以灰度值表示KLF6的相对表达水平。

2结果

2.1外观观察对照组小鼠肺外观呈粉红色,无明显异常改变；低感染组小鼠3 h时可见肺组织表面散在点状出血，9、24 h肺体积增大,呈暗红色,且有片状出血。

2.2病理学观察光镜下可见低感染组小鼠肺组织大量炎性细胞浸润,肺泡隔增厚，肺泡壁结构破坏，局部有肺泡膨胀不全或肺泡塌陷,并扩散到肺间质内，24 h时炎症改变最为严重；而对照组各时间点肺泡结构完整，肺泡腔内清晰，肺泡间隔均一，肺泡、肺间质内无明显炎性细胞浸润(见图1，本文彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

注：a为对照组肺组织病理切片，b～d分别为低感染组3、9、24 h肺组织病理切片

图1两组小鼠肺组织病理变化(HE染色，×400)

Figure 1Pathological changes of lung tissue of two groups

2.3肺组织湿干重之比3 h时,对照组和低感染组肺组织湿干重之比比较，差异无统计学意义(P>0.05)；9、24 h时，低感染组肺组织湿干重之比大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.4凋亡指数低感染组不同时间肺组织凋亡指数比较，差异有统计学意义(P<0.05)；随着感染时间延长，肺组织凋亡指数呈增长趋势(P<0.05,见表2)。不同剂量铜绿假单胞菌感染9 h后肺组织凋亡指数比较，差异有统计学意义(P<0.05)；随着剂量的增加，肺组织凋亡指数呈增长趋势(P<0.05,见表3)。

Table 1Comparison of wet and dry weight ratio between control group and low-infection group at different time points

组别只数3h9h24h对照组54.49±0.304.55±0.234.70±0.38低感染组54.77±0.166.38±1.087.94±1.29t值1.7803.7065.370P值0.1120.0210.006

Table 2Comparison of lung tissue apoptosis index of low-infection group among different time points

时间(h)凋亡指数316±2924±3a2434±3abF值54.520P值<0.001

注：与3 h比较，aP<0.05；与9 h比较，bP<0.05

Table 3Comparison of lung tissue apoptosis index at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

组别只数凋亡指数对照组58±1低感染组524±3a中感染组532±3ab高感染组541±3abcF值132.469P值<0.001

注：与对照组比较，aP<0.05；与低感染组比较，bP<0.05；与中感染组比较，cP<0.05

2.5肺组织中NO水平和iNOS活性比较3、9、24 h时，低感染组肺组织NO水平、iNOS活性均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4、5)。不同剂量铜绿假单胞菌感染9 h后肺组织NO水平、iNOS活性比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中，低感染组、中感染组和高感染组肺组织NO水平、iNOS活性高于对照组，中感染组和高感染组肺组织iNOS活性高于低感染组，高感染组肺组织iNOS活性高于中感染组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表6)。

2.6肺组织KLF6表达水平比较低感染组不同时间肺组织KLF6表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；随着感染时间延长，肺组织KLF6表达水平呈增长趋势(P<0.05，见表7)。不同剂量铜绿假单胞菌感染9 h后肺组织KLF6表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；随着剂量的增加，肺组织KLF6表达水平呈增长趋势(P<0.05，见表8)。

Table 4Comparison of NO level between control group and low-infection group at different time points

组别只数3h9h24h对照组51.13±0.521.40±0.39 1.66±0.39 低感染组52.84±0.368.43±1.1213.69±1.44t值6.10713.21718.059P值<0.001<0.001<0.001

Table 5Comparison of iNOS activity between control group and low-infection group at different time points

组别只数3h9h24h对照组50.21±0.110.25±0.150.31±0.10低感染组50.56±0.060.93±0.221.61±0.12t值6.1945.75918.779P值<0.001<0.001<0.001

Table 6Comparison of NO level and iNOS activity at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

组别只数NO(mmol/gprot)iNOS活性(U/mgprot)对照组51.40±0.390.25±0.15低感染组58.43±1.12a0.93±0.22a中感染组59.57±1.25a1.24±0.19ab高感染组511.07±1.47a1.64±0.23abcF值71.30042.186P值<0.001<0.001

注：NO=一氧化氮，iNOS=诱导型一氧化氮合酶；与对照组比较，aP<0.05；与低感染组比较，bP<0.05；与中感染组比较，cP<0.05

Table 7Comparison of the KLF6 expression of low-infection group among different time points

时间(h)KLF6349.52±2.04957.64±3.84a2469.01±3.50abF值46.130P值<0.001

注：KLF6=Krupple样因子6；与3 h比较，aP<0.05；与9 h比较，bP<0.05

Table 8Comparison of KLF6 expression at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

组别只数KLF6对照组541.64±2.62低感染组557.64±3.84a中感染组569.57±3.01ab高感染组585.66±5.18abcF值120.520P值<0.001

注：与对照组比较，aP<0.05；与低感染组比较，bP<0.05；与中感染组比较，cP<0.05

3讨论

铜绿假单胞菌广泛存在于土壤、水、空气，以及正常人的皮肤、呼吸道、肠道，在人体是一种条件致病菌，易感染免疫力低下人群。由于人口老龄化、HIV广泛传播以及结核病复燃的趋势，使得免疫力低下人群广泛存在，加之抗生素滥用，面临难治性铜绿假单胞菌感染的风险。

KLF6是Sp/Kruppel 样锌指转录因子家族成员之一，能够参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等生命过程，并与肿瘤等多种疾病有关[6]。有研究表明，KLF6基因的表达受到多种生理过程的调控，并且被诱导表达的KLF6能调节应激过程[7-8]。BOTELLA等[9]研究进一步阐明了肝星状细胞的激活、结构基因及细胞因子的刺激能诱导KLF6表达迅速增高。在氰化钠诱导的缺氧时，原发性T淋巴细胞中KLF6的iNOS启动子结合位点增加，导致增加内源性iNOS基因的表达，释放更多的NO[10]。本研究中，小鼠感染铜绿假单胞菌后，肺组织明显充血、水肿、大量炎性细胞浸润，且随着时间的延长，肺组织病理改变越重，湿干重之比也越高，KLF6表达水平升高，iNOS活性升高，NO水平升高，细胞凋亡指数增加，说明铜绿假单胞菌感染肺组织可诱导KLF6的表达，有可能通过调控iNOS产生NO增加细胞凋亡率。为进一步验该推论，本研究对小鼠注射不同剂量铜绿假单胞菌，而随着剂量的增加，KLF6表达水平升高，iNOS活性及NO水平亦明显升高，进一步支持KLF6有可能通过调控iNOS产生NO增加细胞凋亡率。近年研究表明，NO的抗菌活性是通过作为吞噬细胞衍生的氧化剂而体现的，已知因素包括部分细胞因子和微生物产品调节iNOS的水平，iNOS活性的重要性是与宿主的防御和炎性反应一致[11]。

综上所述，随着肺组织炎症的加重，肺组织KLF6表达水平升高，且随着iNOS活性和NO水平升高，细胞凋亡指数增加，提示铜绿假单胞菌感染能诱导KLF6的表达，并有可能通过iNOS调控介导细胞凋亡，为治疗铜绿假单胞菌感染提供新的思路。

作者贡献：喻志芳进行课题设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；韩彬进行课题实施、评估、资料收集；柴文戍进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

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(本文编辑：吴立波)

KLF6 and iNOS Regulated Apoptosis During Pseudomonas Aeruginosa Lung Infection in Mice

YUZhi-fang,HANBin,CHAIWen-shu.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

【Abstract】ObjectiveTo research the changes of KLF6 expression in lung tissue with pseudomonas aeruginosa infection and investigate the mechanism of KLF6 and iNOS regulated apoptosis during pseudomonas aeruginosa lung infection in mice.MethodsFrom October to December in 2014,30 mice were randomly divided into control group and low-infection group,with 15 mice in each group.The low-infection group was injected with pseudomonas aeruginosa by 1.0×107 CFU to make models;5 mice were randomly selected respectively at 3,9 and 24 hours.Other 10 mice were divided into medium-infection group and high-infection group,with 5 mice in each group.Medium-infection group and high-infection group were infected with pseudomonas aeruginosa by 5.0×107 CFU and 1.0×108 CFU respectively,and samples were obtained 9 hours later.At each time point mentioned above,animals were killed to perform sterile separation of their lung tissue,and litigation was conducted on the left lung to determine wet and dry weight ratio.Lung tissue apoptosis index was detected using TUNEL method,and NO level was determined using nitrale reduetase method,iNOS activity was determined by chemical colorimetry.The KLF6 expression of lung tissue was detected by Western blotting.ResultsUsing the microscope,we observed much inflammatory cell infiltration,thickened alveolar septa,destroyed structure of the alveolar wall,and local alveolar atelectasis or alveolar collapse spreading to pulmonary interstitium;the inflammatory changes became the severest at 24 h.At 3 h,control group and low-infection group were not significantly different in wet and dry weight ratio(P>0.05);at 9 and 24 h,low-infection group was higher than control group in wet and dry weight ratio(P<0.05).There were significant differences in the lung tissue apoptosis index of low-infection group among different time points(P<0.05).There were significant differences in the lung tissue apoptosis index among different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused at 9 h(P<0.05).At 3,9 and 24 h,the low-infection group was higher than control group in NO level and iNOS activity(P<0.05).Different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused significant differences in NO level and iNOS activity at 9 h(P<0.05).There were significant differences in KLF6 expression of low-infection group among different time points(P<0.05).Different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused significant differences in KLF6 expression at 9 h(P<0.05).ConclusionPseudomonas aeruginosa infection can induce the expression of KLF6,and may mediate cell apoptosis by the regulation of iNOS.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa；KLF6；Nitric oxide synthase；Apoptosis

基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(2014022015，20092189)

通信作者：柴文戍，121001辽宁省锦州市，锦州医科大学附属第一医院呼吸内科；E-mail：cws1964@163.com

【中图分类号】R 378.991

【文献标识码】A

DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.20.016

(收稿日期：2015-11-11；修回日期：2016-03-24)