胃癌细胞增殖中长链非编码RNAMEG3产生的具体影响分析

刘婵　马东升　于林芳

[摘要] 目的 分析长链非编码RNAMEG3在胃癌组织中的表达水平，并探讨MEG3过表达对胃癌细胞增殖产生的具体影响。方法 将正常胃组织和细胞作为对照组，将胃癌组织和细胞的MEG3表达水平作为观察组，采用qRT-PCR（定量反转录PCR）技术对观察组的MEG3表达水平进行检测，利用转染pcDNA-MEG3将其上调，检测其转染率。然后将上调后MEG3水平对BGC-823和MGC-803细胞的增殖能力的影响采用MTT实验进行检测，并对两种细胞中的p53蛋白水平进行Western blot检测。结果 （1）用荧光定量PCR测量36例胃癌组织及对应癌旁组织组正常组织中MEG3相对表达水平均存在显著差异，具有统计学意义（P<0.05）。（2）MGC-803和BGC-823细胞经转染pcDNA-MEG3后，MEG3水平和对照组比较，显著上升310和251倍，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）经MTT实验，MEG3水平上升后，MGC-803和BGC-823细胞的增殖能力显著下降（P<0.05）。（4）和对照组比较，MGC-803和BGC-823经转染pcDNA-MEG3后，其中p53的表达显著增加（P<0.05）。结论 胃癌组织和细胞中的MEG3下降可以抑制p53蛋白的激活，从而导致胃癌细胞增殖，影响胃癌的发展进程。

[关键词] 胃癌；细胞增殖；长链非编码RNA；MEG3；具体影响

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2016）09-21-04

[Abstract] Objective To analyze the long non-coding RNA MEG3 expression levels in gastric cancer and explore MEG3 specific impact on gastric cancer cell proliferation by over-expression. Methods The normal gastric tissues and cells as the control group， the expression levels of gastric carcinoma cells and MEG3 as the observation group， using qRT-PCR（quantitative reverse transcription PCR） technique MEG3 expression levels in the observation group were detected using transfection pcDNA-MEG3 be raised， to detect the transfection efficiency. Then after impact MEG3 raise the level of proliferation of BGC-823 and MGC-803 cells using MTT assay testing， and by Western blot detection of two cells p53 protein levels. Results （1）measuring 36 cases of gastric cancer tissues and the corresponding normal tissues adjacent to cancer tissue groups in the presence of water on average relative expression MEG3 significant difference was statistically significant（P<0.05） with fluorescence quantitative PCR. （2）MGC-803 and BGC-823 cells were transfected with pcDNA-MEG3， compared with a significant increase in the level of the control group MEG3 310 and 251 times the difference between the groups was significantly（P<0.05）. （3）By MTT assay， after rising MEG3 level， proliferation MGC-803 and BGC-823 cells was significantly decreased（P<0.05）. （4）And the control group， MGC-803 and BGC-823 transfected pcDNA-MEG3， which significantly increased the expression of p53（P<0.05）. Conclusion The gastric cancer tissues and cells MEG3 decline can inhibit the activation of p53 protein， leading to gastric cancer cell proliferation and the development process of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer； Cell proliferation； Long chain non encoding RNA； MEG3；Specific effects

经全球相关统计数据显示，胃癌已经成为癌症死亡中的第二杀手，而且随着人们饮食习惯的变化，该病的发生率正逐年上升[1-3]。由于胃癌早期并不具备典型的临床症状，故确诊人数有限，多以进展期的胃癌为主，而且大部分确诊患者会伴随腹

腔内侵袭、转移和淋巴结转移，所以很难取得令人满意的临床治疗效果，预后效果不佳，5年生存率不足1/10[4-6]。正因如此，掌握胃癌的病理机制和分子水平的变化对于发展生物的诊断标志物具有重要意义，可以为胃癌的有效治疗提供科学依据。长链非编码RNA具有很多生物学功能，而且在很多生物进程中具有重要作用。有研究显示[7-8]，lncRNA的变异和调节功能异常是导致肿瘤的重要因素，所以确定与癌症密切相关的lncRNA，对其生物和分子学作用进行研究对于肿瘤的研究具有重要意义。为了分析长链非编码RNAMEG3在胃癌组织中的表达水平，并探讨MEG3过表达对胃癌细胞增殖产生的具体影响，我院进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院在2008年4月～2012年12月期间收治的胃癌手术治疗患者共36例，入选者均符国际胃癌诊断和分期标准，且术前未接受任何局部或全身治疗。将36例胃癌手术患者归为观察组，组内男21例，女15例；年龄34～59岁，平均（48.3±3.9）岁。选取另36例胃部健康人群归为对照组，组内男20例，女16例；年龄32～58岁，平均（47.1±3.4）岁。两组研究对象在性别、年龄等方面无明显差异（P>0.05），具有可比性。

病理组织样本采集后立刻行液氮冷冻，置于-80℃环境中保存待检。本次研究经我院伦理组织委员会批准，且患者均自愿签署《知情同意书》。购置专业的SGC7901、MGC-803和BGC-823胃癌细胞系以及正常胃黏膜上皮细胞系GES-1，在37℃以及5%二氧化碳的恒温箱中，上述细胞系均接受高糖DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素进行细菌培养，每24～48小时更换一次培养基，当细胞融合度达到80%～90%时开始传代培养。

1.2 研究方法

1.2.1 提取RNA和qRT-PCR 将正常胃组织和细胞作为对照组，将胃癌组织和细胞的MEG3表达水平作为观察组，采用TRIzol试剂（福州晶康生物技术有限公司；产品规格：100mL；产品编号：RP1001）提取培养细胞中或组织中的总RNA，通过转录盒使其反转录为cRNA，并使用专门试剂（一步法快速PCR检测试剂盒，规格200×25μL，商品型号DDM0069A-25μL×200）进行实时PCR检测。检测结果采用GAPDH进行量化表达，记录MEG3以及GAPDH的上下游PCR引物。在ABI 7500平台上收集数据和qRT-PCR结果，并采用标准方法对MEG3的表达进行计算。

1.2.2 构建和转染质粒 MEG3序列经合成和反克隆为pcDNA载体，经pcDNA-MEG3转染对MEG3的异常水平进行表达，并将空pcDNA载体作为对照，使用qPCR检验MEG3的表达水平。所有pcDNA-MEG3和空pcDNA载体均经专门试剂盒提取，严格按照其说明书进行操作，将其转染到6孔平板进行细胞培养，于2d后收集细胞进行qRT-PCR和Western blot分析，以及细胞增殖实验。

1.3 统计学处理

本次研究数据采用SPSS19.0软件包进行统计分析，对重要指标进行给出95%CI区间，并对其相关数据进行χ2或t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织中的MEG3水平

用荧光定量PCR测量36例胃癌组织及对应癌旁组织组正常组织中MEG3相对表达水平，其中MEG3表达水平为（△CT=8.1542±1.571），显著低于癌旁正常组织中的表达水平（△CT=6.224±1.976），组间差异显著（t=4.5872，P=0.025<0.05）具有统计学意义。

2.2 体外实验外源性上调MEG3表达水平对胃癌细胞增殖的影响

MGC-803和BGC-823细胞经转染pcDNA-MEG3后，MEG3水平和对照组比较，显著上升310和251倍，组间差异显著（t=2.036，P=0.002<0.05）。经MTT实验，MEG3水平上升后，MGC-803和BGC-823细胞的增殖能力显著下降（t=3.632，P=0.000<0.05）。

2.3 MEG3诱导p53蛋白激活

和对照组比较，MGC-803和BGC-823经转染pcDNA-MEG3后，其中p53的表达显著增加（t=1.945，P=0.004<0.05）。具体见图1。

3 讨论

胃癌属于多因素和异质性的侵袭性疾病，是各种癌症患者中死亡率较高的一种疾病类型，已经成为全球范围内引起广泛关注的公共卫生问题。目前，胃癌很难彻底治愈，且预后效果和确诊时胃癌的分期具有密切关联，将癌组织完全切除是目前治疗胃癌的唯一有效措施[9-11]。

在胃癌患者的细胞水平表达中，早期患者和远期发展患者的一系列复杂分子的异常将会对正常细胞的功能造成严重影响，在遗传和表观遗传学修饰的作用下，很多基因在正常细胞和受影响的细胞中的表达会存在明显的差异。因此，对这些的发生异常变化的分子进行研究，对于深刻了解癌细胞生物学的行为机制以及胃癌具有重要意义[12-14]。

近年来，随着长链非编码RNA的研究逐渐深入，它的异常表达对胃癌发生以及发展机制的影响研究也开始深入[15-16]。所以，本次研究通过检测长链非编码 RNAMEG3在胃癌组织及细胞系中的表达水平，以及其过表达对胃癌细胞增殖能力的影响，以此来确立MEG3水平和胃癌发生发展的关系，结合前人实验的MEG3对其他肿瘤细胞增殖的抑制机制，来推测其可能的在胃癌发生发展中的作用机制[17-19]。

在本次研究中，相对于正常健康胃部组织而言，存在癌细胞的胃部组织及细胞中的MEG3水平明显更低，组间各细胞中的MEG3表达水平均存在显著差异，具有统计学意义（P<0.05）。这一结果说明，MEG3水平可成为胃癌的诊断依据。和对照组比较，MGC-803和BGC-823经转染pcDNA-MEG3后，其中p53的表达显著增加（P<0.05）。这一结果充分说明，提高MGC-803和BGC-823细胞中的MEG3水平有助于提高p53的表达，可能提示MGC-803和BGC-823MEG3在胃癌发生发展中可能通过促进p53的激活而发挥抑癌作用[20-23]。

由此可知，胃癌组织和细胞中的MEG3下降可以抑制p53蛋白的激活，从而导致胃癌细胞增殖，影响胃癌的发展进程。当然，MEG3水平对胃癌细胞增殖的影响可能不仅仅限于p53，所以还有待进行更深入的后续研究。

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（收稿日期：2015-12-02）