红芸豆植物凝集素长期阴道给药对小鼠阴道上皮细胞的影响

王静静 秦 普 姚娅婷 杨 姚 张 田 王敏康

云南师范大学生命科学学院、云南省生物质能与环境生物技术重点实验室、生物能源持续开发利用教育部工程研究中心(昆明, 650500)

·基础研究·

红芸豆植物凝集素长期阴道给药对小鼠阴道上皮细胞的影响

王静静 秦 普 姚娅婷 杨 姚 张 田 王敏康*

云南师范大学生命科学学院、云南省生物质能与环境生物技术重点实验室、生物能源持续开发利用教育部工程研究中心(昆明, 650500)

目的：观察长期阴道使用红芸豆植物凝集素(RKBL)对小鼠阴道上皮细胞的影响。方法：使用不同浓度的RKBL注入小鼠阴道连续给药4个月后断颈处死小鼠，取其阴道及周围组织，制作石蜡切片并经苏木精染色，显微镜下观察阴道组织的形态学变化。结果：小鼠阴道在浓度≤2.5mg/只的RKBL处理后，无炎症病变，阴道粘膜上皮细胞形态完好无破损，皮下组织形态正常。而当给药浓度提高到5mg/只时，阴道黏膜浅层上皮细胞出现空泡化。结论：浓度≤2.5mg/只的RKBL长期使用不会引起阴道黏膜上皮细胞及皮下组织的不良反应。

红芸豆；植物凝集素；杀微生物剂；小鼠；阴道上皮细胞；切片

杀微生物剂是一种作用于阴道或直肠内，可以杀死病原体的天然或合成材料，可以防止人类免疫缺陷病毒(HIV)和其他性传播疾病(STDs)的感染[1]。近几年的研究显示，杀微生物剂作为一种新型预防STDs的药剂，越来越受到人们的关注。目前国内外所面临的STDs包括艾滋病(AIDS)的威胁越来越严峻，仅具备避孕作用的药物便显现出了局限性[2]。所以寻找高效、安全，兼具抗STDs功能的杀微生物剂[3]成为研究热点。在植物凝集素(PHA)抗HIV能力方面，Balzarini等[4]的研究表明，来源于几种植物的甘露糖结合型凝集素可抑制HIV的复制，另外，N-乙酰葡萄糖胺结合型凝集素可防止HIV进入T淋巴细胞。这两类凝集素在体外培养中还可以阻止人类T淋巴细胞病毒在细胞间传播[5]。芸豆植物凝集素(KBL)还可有效凝集包括人类在内的不同种动物的精子，从而达到避孕的目的。实验证明低浓度PHA能使绝大部分精子失去游动能力，高浓度则会使精子完全失去活力[6]。KBL因具备上述特性，将有可能发展成为一种既能凝集精子、抑制受精，又能阻止HIV病毒进入细胞的局部使用的杀微生物剂[7]。利用PHA阻断STDs，旨在阴道内建立一道精液与阴道黏膜上皮之间保护屏障，在凝集精子、发挥避孕作用的同时，也可阻止病毒穿越屏障感染细胞。本实验以不同浓度的红芸豆植物凝集素(RKBL)注入小鼠阴道内，观察不同浓度的RKBL长期作用于阴道内壁，是否会损坏阴道上皮黏膜细胞，以期为KBL作为阴道内杀微生物剂进入临床使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂的制备

RKBL由本实验室从红芸豆中提取，然后浓缩至所需浓度，采用双缩脲法测定其蛋白质含量。设置高中低3个药物处理组，蛋白含量分别为250mg/ml、125mg/ml和50mg/ml,每只小鼠注入0.02ml。

1.2 实验动物及取材

体重约为20～24g的雌性小白鼠(昆明医科大学实验动物中心购入)在室温21～24℃条件下饲养，光照条件为12L:12D，自由摄食和饮水，动物适应1周后进行实验，实验前动物体重无显著差异。阴道给予不同浓度的RKBL。按王昌梅[6]等的剂量设定，48只雌性小白鼠随机分为4组，每组12只。其中一组为对照组，采用阴道注入的给药方式注射0.02 ml磷酸缓冲液。另外3组为实验组，即高、中、低剂量组，均采用同样方式注入含量分别为250 mg/ml、125 mg/ml和50 mg/ml的RKBL，每只注入0.02 ml，即5 mg/只、2.5 mg/只和1 mg/只。每48 h给一次药，连续给药4个月后先进行血样采集，然后处死小鼠并分离脏器，同时分离阴道及周围组织；固定在10%中性甲醛固定液中，待组织切片。

1.3 显微观察

石蜡包埋和切片步骤参照文献[8]进行。每组随机抽取6个小鼠阴道样本连续切片(厚度为10 μm)，用苏木精-伊红(HE)染色，镜检观察，观察的切片均来自阴道的中部，每只小鼠材料观察4～5张切片并拍照记录。

2 结果

2.1 阴道黏膜上皮给药后观察

肉眼观察，经过3种浓度的RKBL长期作用，小鼠阴道粘膜均未出现明显异常及充血、水肿或其他明显病理改变，肉眼未观察到阴道粘膜上皮出现毒理效应。在光学显微镜下观察到，中剂量组和低剂量组小鼠阴道粘膜表面的上皮细胞无破损现象，层次清晰，排列有序，没有炎症、增生、病变现象；而高剂量组(图1G、H)阴道粘膜浅层上皮细胞的细胞膜完整，胞质出现空泡化现象；中剂量组和低剂量组与对照组切片比较均未出现明显差异(图1A-1H)。

3 讨论

目前市面上还没有一种安全有效的的杀微生物剂产品。 现阶段很多已经进人体临床试验的药物一般都是凝胶剂型或生物黏附剂型[9-12]。常见的杀精子剂为壬苯聚醇-9，但壬苯聚醇-9会引起阴道上皮细胞的破损，而阴道上皮的损伤又将会增加包括HIV在内的病毒的感染风险。并且已有实验证明壬苯聚醇-9会引起直肠上皮的明显大片脱落[13]。世界卫生组织(WHO)在2001年就已发布报告，称含壬苯聚醇-9的杀精子剂不但不能起到预防HIV的作用，反而会增高HIV感染的风险[13]。

实验结果证明，在对小鼠进行长期阴道注入浓度≤2.5mg/只的RKBL后，光学显微镜下阴道组织及上皮细胞完整，无破损、裂解现象。细胞排列有序，层次清晰，没有出现炎症或组织增生现象。与对照组没有明显差异。由此可见，浓度≤2.5mg/只的RKBL不会引起小鼠阴道上皮细胞的不良反应，应用于阴道是安全的。之前也有实验证明芸豆PHA对妇女阴道无刺激，不会产生任何不适感[14]。并且已有实验表明一些PHA能够抑制HIV整合酶的作用，其中RKBL在一定程度上可以抑制HIV-1整合酶[15-16]。PHA与其他临床上用于抗AIDS的药物共用时，几乎不影响其它药物的抗病毒活[15-16]。本实验室以往的研究发现，低浓度RKBL能有效地凝集精子，高浓度则直接致死精子，因此RKBL可有效抑制受精。此外，每天对小鼠阴道注射RKBL(≤2.5 mg/只)，连续注射4个月，不会影响小鼠的正常摄食和行为，并且不会影响小鼠的尿液生化指标和脏器系数，但对小鼠的一些血液学和生化指标影响不明确(本实验室未发表资料)。

本研究结果表明，对小鼠进行阴道注射RKBL 2.5 mg/只的剂量是安全的，按昆明小鼠体重为40 g估算，即小鼠安全剂量为62.5 mg/kg体重，按动物与人体间的等效剂量换算[17]，可推算其对应的成人剂量为5.1 mg/kg。按人类女性体重为50 kg估算，人类的安全剂量为253.1 mg/人。根据本实验室以往研究结果及人体应用实践，拟定的人体使用剂量是安全剂量的1/16～1/10。这也说明了RKBL在人类女性阴道使用具有很高的安全性。在开发避孕和抑菌抗病毒凝胶中，KBL浓度仅为5mg/ml, 按每次避孕剂量3～4ml计算，实际使用量为15～20mg，不足壬苯醇醚类避孕杀精剂浓度的50%。另外， KBL还可促进阴道乳酸菌的增殖，维护阴道和肠道的益生菌平衡[18]。基于上述优点，笔者认为KBL既适合于具有避孕作用的阴道内杀微生物剂，也适合于直肠使用，在临床应用中具有广阔的前景。

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[责任编辑：王丽娜]

The influence of vaginal injected red kidney bean lectin for a long time on vaginal epithelial cells of mice

WANG Jingjing, QIN Pu, YAO Yating, YANG Yao, ZHANG Tian, WANG Minkang*

SchoolofLifeSciences，YunnanNormalUniversity；KeyLabofYunnanProvinceforBiomassEnergyandEnvironmentalBiotechnology；EngineeringResearchCenterofSustainableDevelopmentandUtilizationofBiomassEnergy，MinistryofEducation, 650500

*Correspondingauthor：wangmk1998@163.corn

Objective: To explore the influence of vaginal injected red kidney bean lectin(RKBL) on vaginal epithelial cells of mice. Method: Mice were injected vagina of different concentrations of RKBL for four months continually, and all mice were decapitated after four months administration and their vagina and surrounding tissues were fixed in formaldehyde solution. In order to investigating their histological changes, the vaginas tissues were done paraffin section and hematoxylin eosin stained. Result: When concentrations of RKBL at 2.5mg or below injected in each mouse for four months administration, vaginal mucous membrane were non hyperemia inflammation expression, and the vaginal epithelial cells or tissues remained intact and normal form. While the concentration of RKBL increased to 5 mg, vaginal mucosa epithelial cells had changed with cavitation. Conclusion: When the concentrations of RKBL at 2.5mg or below by vaginal injected for a long time, there is no any side effect on vaginal epithelial cells or subcutaneous tissue.

Red kidney bean; Lectin; Microbicides; Mice; Vaginal epithelial cells; Slice

国家自然科学基金项目(31160244); 科技型中小企业技术创新基金项目(13C26215305477); 云南省教厅重大专项(ZD2011008); 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心及云南省生物质能与环境生物技术重点实验室联合开放基金项目(20100506)等

2016-06-13

2016-08-20

10.3969/j.issn.1004-8189.2016.11

*通讯作者：wangmk1998@163.com