禽流感灭活疫苗H5N2 D7株与H5N1 Re-6株对鸭的免疫效果研究

朱建翠，彭南秀，谭　海，陈耀棠，张　桢，王　令，何日文，杨建宇，陈裕华，朱家辉，张海明，曾树河，齐　敏，郑丽兰，黄　森，杨穗娟，钟卓玲，张志茂（.广州市动物卫生监督所，广东广州　50440；. 广州市番禺区动物防疫监督所，广东广州　5499；. 广州市番禺区石楼镇畜牧兽医站，广东广州　5447）



禽流感灭活疫苗H5N2 D7株与H5N1 Re-6株对鸭的免疫效果研究

朱建翠1，彭南秀1，谭海1，陈耀棠2，张桢1，王令1，何日文1，杨建宇1，陈裕华1，朱家辉1，张海明1，曾树河3，齐敏1，郑丽兰1，黄森1，杨穗娟1，钟卓玲1，张志茂1
（1.广州市动物卫生监督所，广东广州510440；2. 广州市番禺区动物防疫监督所，广东广州511499；3. 广州市番禺区石楼镇畜牧兽医站，广东广州511447）

摘要：为评价禽流感灭活疫苗（H5N2亚型，D7株）和重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）对鸭的免疫效果，根据兽医流行病学中利用比较率判断疫苗应用效果的样本量计算方法，得出所需的最小样本量；以田间试验的方式，常规养殖白鸭300只、番鸭240只，并对其进行随机分组；按程序免疫，从10日龄首免后2周开始，每周采集血清测定抗体效价，直至出栏（白鸭45日龄、番鸭66日龄）。结果显示，10日龄白鸭和番鸭的母源抗体分别为3.02 log2和0 log2，需进一步开展研究，以确定最佳首免时间。首免后2周，无论是白鸭还是番鸭，H5N2 D7株疫苗组抗体HI效价和抗体合格率均高于H5N1 Re-6株疫苗组；首免后3～5周，两种疫苗对白鸭和番鸭的HI效价均＞4 log2，抗体合格率均≥70%。二免后1周至出栏，两种疫苗对白鸭和番鸭均产生较好的免疫效果，HI效价均＞7 log2，抗体合格率均＞80%。是否采用对应亚型的血凝抑制抗原对抗体的检测结果有较大影响。研究表明：免疫两种疫苗后均能产生较好的免疫抗体，但相对而言，H5N2 D7株疫苗较H5N1 Re-6株疫苗更适合于鸭的免疫；在鸭等水禽中推广使用该疫苗将能更有效地防控高致病性禽流感。

关键词：鸭；禽流感；灭活苗；H5N1；H5N2；免疫效果；比较

以往研究表明，鸭是禽流感病毒的贮存库，所有A型流感的HA亚型（H1～H15）和NA亚型（N1～N9）都曾在鸭体内被发现［1］，因此鸭被认为在禽流感的传播扩散和生物学进化中起了十分重要的作用［2-4］。以往认为，鸭仅仅是禽流感病毒的携带者，但20世纪90年代中期以来，家鸭在亚洲的多起禽流感疫情中发病死亡的事实，说明鸭不仅仅是流感病毒的贮存库，还是对禽流感高度易感的禽类［5］。

疫苗免疫是防止禽流感疫情发生的最有效手段之一，而免疫后抗体水平的高低则是评估实际免疫效果的重要指标［6］。目前我国使用较多的是H5N1禽流感疫苗。我国华南地区自2013年起，将重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型Re-6株，以下简称Re-6株疫苗）作为政府采购的强制免疫苗，但其对水禽的免疫效果并不十分理想，临床上常发生免疫失败［7］。为此，我国科研工作者利用从野鸭中分离到的H5N2亚型自然弱毒株，研制出水禽专用禽流感灭活疫苗（H5N2亚型D7株，以下简称D7株疫苗），俗称水禽专用苗。由于D7株疫苗投入生产使用仅一年多时间，养殖户对其免疫效果了解不多，对其免疫效果的反馈好坏不一，对其实际免疫效果的报道也较少。鉴于此，本研究通过田间试验，用D7株疫苗和Re-6株疫苗分别免疫白鸭和番鸭，定期采集血清测定HI抗体效价，研究两种疫苗免疫后HI抗体消长规律及其差异，比较两种疫苗的免疫效果，为指导临床使用提供科学依据。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1试验动物。2日龄白鸭（品种为樱桃谷）和番鸭，购自广州市番禺区某种鸭场。在选定的养殖场按当地养殖户常规方法饲养至出栏（白鸭45日龄、番鸭66日龄）。

1.1.2试验疫苗。禽流感灭活疫苗（H5N2亚型，D7株），批号：2014036，广州市华南农大生物药品有限公司生产；重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株），批号：201516，哈药集团生物疫苗有限公司生产。

1.1.3检测试剂。H5N2亚型HI试验抗原和阳性血清，批号：20150507，广州市华南农大生物药品有限公司生产；H5N1亚型HI试验抗原（Re-6株）和阳性血清，批号：2015032，哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.2方法

1.2.1样本量计算方法。根据兽医流行病学中利用比较率判断疫苗应用效果的样本量计算公式［8］计算样本数量。式中，检验水准α设定为0.05，

Zα为标准正态分布的1-α/2百分位值，是置信水平为1-α时所对应的标准正态分布的临界值，Z0.05=1.96；Zβ为与检验效度（把握度）1-β有关的标准正态分布的（1-β）百分位值。本研究设定β为0.20，把握度1-β为80%，Z0.2=0.84；P1为群体1的预期流行率；P2为群体2的预期流行率；P为群体1和群体2预期流行率的平均值：（p1+p2）/2；q=1-p，q1=1-p1，q2=1-p2。通过比较上一年使用不同疫苗的鸭血清抗体监测的结果，初步估计Re-6株疫苗的抗体合格率p1=40%、D7株疫苗的合格率p2=70%，计算得最小样本量n=42（双尾检验），即每组最少需要42只实验鸭子。综合考虑养殖过程中有15%～20%的死淘率，以及样本的代表性、均衡性、抽血失败等问题，将样本量确定为白鸭每组75只、番鸭每组60只。

1.2.2分组和接种。将新购进的2日龄白鸭和番鸭，各随机分成4组，各组免疫程序见表1。

表1　各组别鸭子的免疫程序

1

1血。白鸭的B1、B3组于首免后2周至出栏，B2、B4组于二免后1周至出栏，每周每组翅静脉采血50份；番鸭的F1、F3组于首免后2周至出栏，F2、F4组于二免后1周至出栏，每周每组翅静脉采血40份。采血量1 mL/只，分离血清-20 ℃保存待检。

1.2.5HI抗体效价测定。按照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T18936-2003）中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术进行。免疫D7株疫苗组用H5N2亚型HI试验抗原和阳性血清检测，免疫Re-6株疫苗组用H5N1亚型HI试验抗原和阳性血清检测；挑选部分血清交叉使用抗原进行检测。HI效价≥4 log2的判定为合格。

1.2.6数据整理和分析。对检测结果用EXCEL、SPSS20.0等软件进行数据整理、统计分析。

2　结果

2.1母源抗体测定情况

2日龄时，白鸭的母源抗体HI效价几何平均值（GMT）为6.24 log2，番鸭为6.68 log2；10日龄时，白鸭GMT降至3.02 log2，番鸭GMT为0 log2，算术均值为1.41 log2。详见表2。

表2　试验鸭母源抗体测定情况

2.2两种疫苗对白鸭的免疫效果比较

2.2.1两种疫苗免疫白鸭后的抗体消长情况。对白鸭进行1次免疫时，免疫后2周（24日龄），D7株疫苗组和Re-6株疫苗组均有抗体产生，HI效价分别为4.35 log2、3.11 log2。随后抗体水平逐渐升高，于免疫后4周（38日龄）时达到最高，后稍有下降；对白鸭二次免疫后1周，两种疫苗的抗体HI效价GMT均＞6 log2，且逐渐升高，直至出栏时，GMT仍保持在8 log2以上。详见图1。

图1　两种疫苗不同免疫次数的白鸭抗体HI效价变化及95%置信区间分布

2.2.2两种疫苗免疫白鸭后的抗体合格率比较。无论是仅进行一次免疫，还是二次免疫，D7株疫苗组和Re-6株疫苗组白鸭的抗体合格率的变化基本一致，仅在一次免疫后2周时，D7株疫苗组的抗体合格率（70%）高于Re-6株疫苗组（24%），差异具有统计学意义（Pearson x2= 21.24，P＜0.01），详见表3。

表3　不同免疫次数两种疫苗免疫白鸭的抗体合格率比较

2.3两种疫苗对番鸭免疫效果比较

2.3.1两种疫苗免疫番鸭的抗体消长情况。仅进行一次免疫时，首免后2周（24日龄），两种疫苗均有抗体产生，但D7株疫苗组HI效价（3.34 log2）高于Re-6株疫苗组（2.17 log2），首免后3～7周，两种疫苗HI效价消长基本一致并稳定在5～6 log2之间。二次免疫后1周（38日龄）起，两种疫苗HI效价GMT均稳定在7 log2以上的高水平，至第4周略有下降。具体变化趋势见图2。

图2　两种疫苗不同免疫次数的番鸭抗体HI效价变化及95%置信区间分布

2.3.2两种疫苗免疫番鸭后抗体合格率比较。两种疫苗组番鸭的抗体合格率的变化基本一致。一次免疫后2周时，D7株疫苗组的抗体合格率（46.67%）高于Re-6株疫苗组（15.79%），差异具有统计学意义（Pearson x2= 7.70，P＜0.01）；二次免疫后4周，Re-6株疫苗组的抗体合格率（100%）高于D7株疫苗组（88.57%），差异具有统计学意义（Pearson x2=6.21，P=0.01），详见表4。

2.4不同亚型抗原对检测结果的影响

2.4.1不同亚型抗原对抗体合格率的影响。选取173份免疫了D7株疫苗的鸭血清和175份免疫了Re-6株疫苗的鸭血清，分别用H5N2亚型抗原和H5N1亚型抗原进行交叉HI试验，结果不同亚型抗原交叉血凝试验结果有较大差异。用对应的抗原检测时，抗体合格率明显高于用非对应抗原检测的合格率（p＜0.01）。具体结果见表5。

表4　不同免疫次数两种疫苗免疫番鸭抗体合格率比较

表5　不同亚型抗原交叉血凝试验结果

2.4.2不同亚型抗原交叉检测的抗原性差异系数。用抗原性差异系数R计算公式［9］分析两种抗原交叉检测对结果的影响，发现D7株疫苗与Re-6株疫苗的抗原性差异系数R为0.62，表明两毒株间抗原性有小的差异，见表6。

注：r1：甲血清对乙抗原的HI效价/甲血清对甲抗原的HI效价；r2：乙血清对甲抗原的HI效价/乙血清对乙抗原的HI效价

表6　不同亚型抗原性差异系数

3　讨论

广州市地处珠江三角洲河网区，水系发达，是国内主要的水禽生产和消费区，2015年广州水禽年出栏量达3 179万只。如何有效防控水禽禽流感已成为广州地区禽流感防控的重要课题。

3.1母源抗体对于保护出生不久的动物免受疫病感染具有十分重要的作用

由于疫苗免疫抗体的产生需要一定的时间，所以只有当母源抗体水平很低甚至为零时才进行免疫。这会导致出现一段免疫空档期，增加了动物疫病的发生风险［10］，因此选择合适的首免时间十分重要。在本研究中，2日龄时，白鸭和番鸭的母源抗体水平均＞6 log2，但到10日龄时，白鸭和番鸭的母源抗体水平已分别降至3.02 log2和0 log2，低于有效保护水平。对于番鸭来说，此时进行首免已明显偏迟，最佳的首免时间有待进一步研究。

3.2一般情况下，HI抗体效价在4～5 log2时能抵御禽流感野毒的侵袭，起到保护作用，而低于4 log2时保护力很差［10］

本次研究发现，首免后2周，仅白鸭D7株疫苗组抗体HI效价＞4 log2，且抗体合格率达到70%。番鸭虽未达到起保护作用的抗体水平，但D7株疫苗组的免疫效果仍然优于Re-6株疫苗组；而首免3周后，无论是白鸭还是番鸭，两种疫苗均能达到具有保护效力的抗体水平，抗体合格率也均达到合格标准（≥70%）。二次免疫组的抗体效价和抗体合格率都远远高于同期仅一次免疫组的水平，说明二次免疫效果明显优于一次免疫。广州市白鸭出栏时间一般为40～45天，部分养殖户仅进行一次免疫，相对于Re-6株疫苗，D7株疫苗能更早达到保护水平，因此更适合于白鸭的禽流感防控。对养殖时间较长的番鸭而言，推广D7株疫苗和10日龄前首免，31日龄加强免疫1次的免疫程序更为合适。

3.3研究发现，D7株疫苗产生的抗体能更早达到保护水平，且抗体持续时间更长，对鸭的免疫效果明显好于Re-6株疫苗，更适合水禽使用

这与国内学者的研究结论［11-12］基本一致。这可能是由于D7株疫苗毒株分离于禽流感的天然宿主鸭，为自然弱毒，免疫原性好，属于我国近年来主要流行的2.3.2分支，较Re-6株疫苗抗原谱更广［10］，故而对水禽有较为理想的免疫保护效果。

3.4本次研究发现，免疫不同亚型疫苗，但未采用同源的HI抗原进行检测，检测的合格率会低于采用同亚型HI抗原的检测结果

建议使用D7株疫苗的地区在进行水禽抗体监测时，应详细记录养殖户使用的疫苗类型，并采用相对应的HI抗原进行检测。

3.5由于受国家有关HPAI 研究要求的限制，本次研究未进一步做攻毒保护试验

吴涛等［13］用5株2010年以后分离的高致病性禽流感流行毒株对免疫了D7株疫苗的鸭进行攻毒保护试验，结果显示疫苗对5株高致病性禽流感流行毒株的攻击均可产生良好的免疫保护作用，并可有效阻止排毒，研究认为推广使用D7株水禽专用疫苗对于水禽的高致病性禽流感防控将发挥重要作用。

参考文献：

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［13］吴涛，毛娅卿，王嘉，等.水禽用H5亚型禽流感灭活疫苗对高致病性禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果研究［J］.中国兽药杂志，2013，47（3）：11-13，30.

（责任编辑：朱迪国）

Comparison of the Immune Efficacy of Avian Influenza Inactivated Vaccine H5N2（D7 stain）and H5N1（Re-6 stain）in Ducks

Zhu Jiancui1，Peng Nanxiu1，Tan Hai1，Chen Yaotang2，Zhang Zhen1，Wang Ling1，He Riwen1，Yang Jianyu1，Chen Yuhua1，Zhu Jiahui1，Zhang Haiming1，Zeng Shuhe3，Qi Min1，Zheng Lilan1，Huang Sen1，Yang Suijuan，Zhong Zhuoling1，Zhang Zhimao1

（1.Guangzhou Animal Health Inspection Institution，Guangzhou，Guangdong 510440；2. Panyu District Animal Epidemic Prevention Supervision Institution of Guangzhou City， Guangzhou，Guangdong 511499；3.Shilou Town Animal Husbandry and Veterinary Station of Panyu District，Guangzhou，Guangdong 511447）

Abstract：To evaluate the immune efficacy of the inactivated avian influenza virus（AIV）H5N2 subtype vaccine（D7 stain）and H5N1 subtype vaccine（Re-6 stain）in ducks，300 white ducks and 240 muscovy ducks were divided into 4 groups respectively，immunized with H5N2 D7 or H5N1 Re-6 inactivated vaccine with given immunization program and raised conventionally. Serum samples were collected each week from two weeks after immunization to the time for marketing. And then the hemagglutinin inhibition（HI）antibody was detected. The results showed that the time for the first immunization for ducks may be questionable as the maternal antibody titer of white ducks and muscovy ducks were 3.5 log2and 1.4 log2，respectively. Two weeks after the first immunization，the HI titers of H5N2 D7 vaccine groups were higher than that of H5N1 Re-6 vaccine group，both for white ducks and muscovy ducks. The HI titers of two kindsof vaccines were all higher than 4 log2，as the qualified rates were higher than 70% both for white ducks and muscovy ducks 3～5 weeks after the first immunization.Since one week after the second immunization till time for marketing，the two vaccines showed good immune effect with antibodies HI titer all ＞7 log2and qualified rates ≥80% in the two kinds of ducks. Besides，there was great influence on the result of the antibody detection using non-corresponding HI subtypes. This study showed that the H5N2 vaccine（D7 stain）was more suitable for ducks and more important for prevention and control of HPAI in waterfowl in China ，although the two kind of vaccines could produce relatively good antibody titers.

Key words：duck；avian influenza；inactivated vaccine；H5N1；H5N2；immune efficacy；comparison

中图分类号：S851.38

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）06-0063-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.019

通讯作者：谭 海，何日文