山东省青岛市2015年禽流感监测分析

马清霞，何宇乾，邴啟政，杨胜男，段笑笑，梁建波，周相华（青岛市动物疫病预防与控制中心，山东青岛　266000）



山东省青岛市2015年禽流感监测分析

马清霞，何宇乾，邴啟政，杨胜男，段笑笑，梁建波，周相华
（青岛市动物疫病预防与控制中心，山东青岛266000）

摘要：［目的］调查青岛市家禽高致病性禽流感免疫水平，测定该地区的禽流感流行率，分析流行的风险因素。［方法］在全市家禽养殖场（户）、农贸市场、屠宰场和野鸟栖息地随机抽样，采用血凝抑制方法测抗体，采用荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病原，同时开展禽流感血清学和病原学检测。利用GIS、EXCEL软件，分析青岛市禽流感检测样品的空间分布、免疫抗体水平、病原流行率及分布。［结果］青岛市家禽H5N1禽流感（Re-6）免疫抗体场户合格率为76.3%，个体合格率为74.8%；H5N1禽流感（Re-7）免疫抗体场户合格率为72.5%，个体合格率为71.4%；H5亚型禽流感病原学检测全部阴性；H9亚型禽流感个体流行率为1.18%，全部来源于农贸市场和屠宰场。［结论］青岛市家禽高致病性禽流感的免疫状况良好，在所有家禽和野禽活动场点未发现高致病性禽流感病毒，表明青岛市高致病性禽流感防控效果较好。

关键词：禽流感；流行率；血清学调查；病原学监测

山东省青岛市家禽养殖量大、养殖密度高、规模化程度低。根据《中国畜牧业年鉴》（2015年）中的数据，截至2015年底，青岛市家禽存栏5 020万只，其中蛋鸡1 333万只、肉鸡3 686万只、水禽248万只。蛋鸡规模场的场户占比为4.10%，养殖数量占全市蛋鸡的67.16%。肉鸡规模场的场户占比为26.20%，养殖数量占全市肉鸡85%。青岛市有正大、九联、万福等大型规模化、标准化肉鸡养殖企业，是我国目前最大的现代化肉鸡养殖基地、出口备案基地和优质鸡肉原料供应基地。作为港口城市，青岛市交通发达，陆路、水路和航空的运输频繁，一旦发生高致病性禽流感，会对青岛市的经济、公共卫生和对外贸易等造成非常大的影响。因此，根据青岛市家禽养殖类型、禽流感发生的风险点，采取随机抽样检测的方法，调查全市家禽高致病性禽流感的群体免疫合格率和个体免疫合格率，评估全市禽流感病毒（包括H5、H7和H9亚型）的个体阳性率和群体阳性率，为青岛市禽流感防控措施的制定提供数据支持。

1　材料与方法

1.1监测对象与范围

监测对象：青岛市范围内的鸡、鸭、鹅和其它家禽及野生禽鸟。

监测范围：种禽场、规模商品禽场、散养户、屠宰场、候鸟主要栖息地和其它重点地区。

规模养殖场：蛋鸡、水禽存栏2 000只以上，肉鸡存栏10 000只以上；散养户：蛋鸡、水禽存栏2 000只以下，肉鸡存栏10 000只以下。

1.2抽样策略与样本量计算

1.2.1血清学检测的抽样策略。以全市所有的家禽养殖场（户）为抽样框，按照二阶段随机抽样策略进行抽样监测。首先根据估计流行率的抽样方法随机抽取养殖场（户），按照预期抗体合格率为90%、可接受误差为5%、置信水平95%计算抽样场（户）数，计算得出青岛市需要采集130个养殖场（户）。在每个养殖场点内，根据发现疫病的抽样策略，随机抽取个体。每个场点按照群内阳性率10%，置信水平95%，随机抽样30份，不足30只的全部采集［1］。

1.2.2病原学检测的抽样策略

病原学检测采用基于风险的抽样策略。在养殖场点，同时开展血清学和病原学检测。根据文献中的禽流感风险分析结果，结合青岛市家禽屠宰场、野鸟栖息地和农贸市场的数量和分布，在每个区市选取交易量最大的3个农贸市场，共21个，在胶州市的大沽河入海口、平度市大泽山、即墨市流浩河湿地、黄岛区的狄家河水库等4个野鸟迁徙路径和候鸟栖息地，2个家禽定点屠宰场进行禽流感病原学检测。在每个场点内，根据发现疫病的抽样方法，随机抽取动物个体。每个场点按照群内阳性率10%，置信水平95%，试验敏感性为100%，每个场点随机抽样30份，不足30只的全部采集［1-2］。

1.3样品来源及场点分布

在全市范围内，随机抽取130个养殖场（户）和21个农贸市场、4个野鸟栖息地和2个家禽屠宰场。具体分布见图1。

图1　禽流感检测的场点数分布

1.4血清学检测

在家禽养殖场采集咽喉/泄殖腔棉拭子的同时，翅下静脉采集全血，分离血清。依据GB/T 18936-2003标准中的血凝抑制试验（HI）方法，使用H5亚型禽流感血凝抗原（Re-6和Re-7）和阳性血清（Re-6和Re-7）（哈尔滨畜牧兽医研究所，批号分别为2014013、2014010和2014001、2014002），测定H5亚型禽流感免疫抗体水平和H7亚型HI抗体滴度。HI抗体滴度在24以上的判为免疫抗体合格或抗体阳性，场户内合格率≥70%的判为抗体合格场户或抗体阳性场户。

1.5病原学检测

采集家禽养殖场家禽的咽喉/泄殖腔棉拭子，野鸟新鲜粪便，屠宰场家禽的肺脏或气管，农贸市场杀鸡用的砧板、刀具、脱毛器上的残留物，用棉签擦拭或采集鸡笼上的鸡粪等样品。

依据GB/T 19438.1-2004、GB/T19438.2-2004、GB/T 19438.3-2004和GB/T 19438.4-2004标准，利用禽流感通用型和H5、H7、H9亚型禽流感荧光定量RT-PCR试剂盒检测禽流感病毒核酸（凯杰生物科技有限公司生产，批号分别为20150102、20150516、20150602和20150512）。

对棉拭子样品和粪便样品，每个样品取200 μL上清液，每5个样品混为1个样品。首先用禽流感通用型荧光RT-PCR方法筛检，对阳性样品，再进行H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感分型检测。

1.6数据分析

个体免疫合格率=（接种禽流感疫苗后免疫合格的动物数/实际接种动物数）×100%

群体免疫合格率=（个体免疫合格率＞70%的场户数/实际接种的场户数）×100%

个体阳性率=（禽流感阳性个体数/检测动物数）×100%

群体阳性率=（禽流感阳性场户数/所有检测场户数）×100%

2　结果

2.1禽流感血清学检测

2.1.1免疫抗体检测。在全市范围内，随机抽取130个养殖场（户），其中，散养户数占49%，规模场数占51%。共采集样品1 909份，其中来源于蛋鸡散养户421份、蛋鸡规模场1 008份、种鸡场240份、水禽规模场150份、肉鸡规模场90份。经检测，全市家禽H5亚型禽流感的整体免疫合格率在70%以上，详见表1。进一步分析不同养殖类型的免疫抗体水平发现，种鸡场、蛋鸡规模场和蛋鸡散养户的H5亚型免疫抗体均较高，而肉鸡规模场和水禽规模场的免疫抗体较低，详见表2。

2.1.2H7亚型抗体检测。对130个场户的1 969份来源于蛋鸡规模场、肉鸡散养户、水禽规模场的家禽血清样品，检测H7亚型抗体，其中有49份样品为阳性，来源于7个养殖场户。H7亚型抗体的场户阳性率为5.38%，个体阳性率为2.48%。其中规模场的场户阳性率为7.57%，散养户的场户阳性率为3.12%。

2.2病原学检测结果

随机选择130个家禽养殖场（户），采集1 909份咽喉/泄殖腔棉拭子。包括64个散养户（421份）、49个蛋鸡规模场（1 008份）、8个种鸡场（240份）、6个水禽场（150份）和3个规模肉鸡场（90份），同时在禽流感高风险场点，随机选取21个农贸市场（110份）、4个野鸟栖息地（120份）、2个屠宰场（60份），共采集290份棉拭子样品。

表1　禽流感的免疫抗体水平

表2　不同养殖类型的禽流感的免疫抗体水平

对来源于上述157个场点的2 199份家禽的咽喉/泄殖腔棉拭子、粪便样品进行禽流感通用荧光定量RT-PCR检测，发现26份阳性，分别来源于2个农贸市场和1个家禽屠宰场。进一步分型检测发现全部为H9亚型。综合检测结果，青岛市H9亚型禽流感个体阳性率为1.18%，场户阳性率为2.00%。110份农贸市场样品中，有9份H9亚型禽流感阳性，农场市场的H9亚型禽流感个体阳性率为7% ，场户阳性率为10%。

3　讨论

本次以2015年秋季集中检测的一个时间点进行横断面检测［3-4］，利用兽医流行病学知识，在不同风险区域采取二阶段随机抽样，调查青岛市家禽禽流感流行状况和免疫水平。在风险较低的养殖场（户），根据估计流行率策略，结合血清学检测进行随机抽样；在风险较高的农贸市场、野鸟栖息地、水禽场等场点，根据发现疫病的策略，采用基于风险的抽样。

根据本次血清学检测结果，青岛市家禽禽流感免疫抗体场户合格率和个体合格率均在70%以上，说明禽流感免疫状况良好。进一步分层分析发现，蛋鸡规模场和散养户抗体合格率均在80%以上，规模肉鸡场和水禽场的抗体水平则较低。通过调查得知，青岛市部分出口备案肉鸡场只免疫H9亚型禽流感，不免疫H5亚型高致病性禽流感。水禽场尽管按程序进行禽流感免疫，但水禽对禽流感疫苗的体液免疫较差，导致免疫抗体水平不高［5］。本次检测在部分养殖场发现H7亚型血清学阳性场群，其对应的棉拭子检测为核酸阴性。经临床观察，这些鸡群无异常。

在蛋鸡规模场、规模肉鸡场、种鸡场、散养户和水禽场等养殖场点的样品中未检测出禽流感病毒，说明养殖场所没有被禽流感病毒污染。这进一步说明，青岛市家禽养殖场所发生禽流感的风险较低。

青岛市处于候鸟迁徙路径上，全市有山林、湖泊、湿地、水库等79处，有391种野鸟。本次随机选取4个候鸟、野鸟秋季迁徙经过的湿地，采集新鲜、湿润的野鸟粪便进行禽流感检测，但未检测出禽流感病毒，说明在青岛市由野鸟引发家禽禽流感的风险较低。

活禽市场（或农贸市场）提供了病毒从禽类传播到包括人在内的哺乳动物的条件。2013年，当活禽市场关闭后，新发的H7N9感染病例几乎为0，但活禽市场开放后又出现了新发病例［6］。本次检测的21个农贸市场的环境、笼具和砧板棉拭子样品中，有8份H9亚型禽流感阳性，分别来源于2个农贸市场。家禽屠宰场也是禽流感病毒检出率较高的地方。本次检测在青岛市2个大型家禽屠宰场中，发现其中1家有H9亚型禽流感阳性。

综上，尽管在养殖环节中没有检测出禽流感病毒，但在全市家禽养殖的末端环境中仍存在禽流感病毒，为避免流通环节的H9亚型禽流感病毒污染养殖环节，家禽养殖场应严格做好生物安全防护措施，对进出养殖场的人员、车辆严格控制和消毒，对养殖场的鸡蛋、粪便等产品做好消毒和无害化处理；严格控制养殖场饲料、兽药来源；养殖场做好封闭管理，严防家禽与野鸟接触。

参考文献：

［1］沈朝建，王幼明. 兽医流行病学调查与监测：抽样技术手册［M］. 北京：中国农业出版社，2013.

［2］沈朝建，刘丽蓉，康京丽，等.以风险为基础调查或监测证明无疫的样本量与敏感性计算［J］. 中国兽医杂志，2014，50（3）：94-96.

［3］张海明，彭聪，刘华. 兽医流行病学调查中的抽样方法概述［J］. 中国动物检疫，2015，32： 55-59.

［4］陈继明. 重大动物疫病监测指南［M］. 北京：中国农业科学技术出版社，2008.

［5］薛峰，张评浒，刘晓文，等. H5亚型禽流感疫苗免疫肉鸡、水禽后抗体消长规律的研究［J］. 扬州大学学报（农业与生命科学版），2005，26：1-3.

［6］Yu H，Wu J T，Cowling B J，et al. Effect of closure of live poultry markets on poultry-to-person transmission of avian influenza A H7N9 virus： an ecological study［J］. Lancet，2014，383： 541-548.

（责任编辑：朱迪国）

Surveillance and Analysis of Avian Influenza in Qingdao City of Shandong Province in 2015

Ma Qingxia，He Yuqian，Bing Qizheng，Yang Shengnan，Duan Xiaoxiao，Liang Jianbo，Zhou Xianghua
（Qingdao Animal Disease Prevention and Control Center，Qingdao，Shandong 266000）

Abstract：［Objective］This paper aims to investigate HPAI immunity level of poultry， to determine avian influenza prevalence and to analyzes corresponding risk factors in Qingdao. ［Methods］ Antibody was tested by hemagglutination inhibition and pathogens of avian influenza through fluorescent quantitative RT-PCR. Spatial distribution of test samples，immune antibody level of the avian influenzas as well as prevalence and distribution of pathogens， were analyzed by GIS and EXCEL. ［Results］ A total of 1969 serology samples from 130 sites and 21992 etiological samples from 17 sites were collected in poultry farms（households），farmer's markets，slaughter houses and wild bird habitats in Qingdao. The immunity qualified rate of poultry farms（households）and individual qualified rate against H5N1（Re-6）were 76.3% and 74.8%， while those against H5N1（Re-7）were 72.5% and 71.4%， respectively. The 100% negative of H5 subtype HPAI and 1.18% individual prevalence of H9 subtype HPAI were reported by etiological test.These H9 AI viruses were from farmer's markets and slaughter houses. ［Conclusion］ HPAI immunity was good in Poultry and no HPAI virus was discovered in all places of poultry and wildfowl in Qingdao.

Key words：avianinfluenza；prevalence；serosurvey；pathogenic surveillance

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）06-0018-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.006