环介导等温扩增技术研究进展

宋玉财，王　彬，王官晓，李　鹏，刘洪明，于晓云，于小川，徐晓静，王俊卿（. 山东省烟台市动物卫生监督所，山东烟台　64003；. 烟台市牟平区龙泉镇兽医站，山东烟台　64003）



环介导等温扩增技术研究进展

宋玉财1，王彬1，王官晓1，李鹏2，刘洪明1，于晓云1，于小川1，徐晓静1，王俊卿1
（1. 山东省烟台市动物卫生监督所，山东烟台264003；2. 烟台市牟平区龙泉镇兽医站，山东烟台264003）

摘要：环介导等温扩增技术（LAMP）是由Notomi等建立的一种核酸扩增技术。该方法最大的优点是能够在63～65 ℃的等温条件下扩增特定DNA序列，并在30～60 min内观察到结果。LAMP已经成功用于许多病毒的检测，本文主要概述了LAMP技术原理及发展现状。

关键词：环介导等温扩增技术；原理；发展现状

1　LAMP技术原理

1.1LAMP引物相关

LAMP反应需要4条引物，分别针对靶序列上6个不同位置，包括一对外引物F3、B3和一对内引物FIP（Forward inner primer）、BIP（Backward inner primer）。FIP由F1C区和F2区构成，BIP由B1c区和B2区构成［1］。图1为各引物所在位置示意图。

引物设计是LAMP反应成功与否的关键。现在通常使用日本荣研株式会社的在线LAMP引物设计程序Primer Explore（http：//www. primerexplorer.jp/e/）完成设计工作。Tm值、引物末端稳定性、GC含量、二级结构和引物间距等几个方面都会影响到引物的品质。之后的报道证实在添加一对环状引物后，可缩短大约一半的LAMP反应时间。

1.2LAMP反应扩增原理

图1　LAMP引物位置示意图

在LAMP反应的开始，FIP引物中的F2片段首先与模板F2c区互补结合，在Bst DNA聚合酶作用下，由模板链的3’端向5’端延伸，而后F3引物与模板的F3c结合。因为Bst DNA聚合酶具有链置换的功能，沿着F3引物扩增出的新链将之前的互补链置换下来。接着BIP引物的B2片段再与这条被置换下的互补链的B2c区结合，过程与之前的F引物相同。一个循环下来就可以得到LAMP反应的起始茎环结构（图2）。在起始结构形成后，循环便只需要两条内引物参与进行，最终产物是一系列含有不同个数茎环结构的DNA混合物（图3）。

图2　LAMP反应的起始结构

图3　含不同个数茎环结构的DNA示意图

2　LAMP的产物检测

LAMP反应的扩增产物可以通过多种方式来获得验证。第一种，它和PCR产物一样可以通过琼脂糖凝胶电泳的方式，与PCR产物电泳后呈现确定大小的单一条带不同，LAMP产物在凝胶成像系统下呈现出特有的阶梯状条带。第二种，也是最适用于基层临床检测的判断方法，可以向LAMP产物中添加SYBR Green I等核酸染料，即能直接通过肉眼来观察结果。以SYBR Green I为例，不扩增的情况反应管内液体为橙红色，而有扩增产物的情况，反应管内的液体则是黄色的。如果肉眼观察还不能肯定结果，只需将反应管置于紫外灯下，在黑暗中呈现明亮荧光的说明模板发生了扩增。第三种，在核酸合成过程中，dNTP不断析出焦磷酸根离子，刚好与体系中的Mg2+作用生成焦磷酸镁沉淀。这本来是副反应的产物，却再次提供了一个肉眼判断结果的方式。LAMP反应完成之后，将反应管离心，如果在管底侧发现白色沉淀，即代表了阳性结果。因为肉眼观察总有误差，2001年日本研制出专用的终点浊度仪来代替肉眼确定结果，此后又设计出了LAMP实时浊度仪，对定量观察反应各时刻的扩增情况提供了条件。

3　LAMP技术的发展及应用

LAMP是2000年由日本学者Notomi等人开发出的一种新型体外核酸扩增技术，它能在1小时内65 ℃左右的等温条件下把数拷贝的DNA扩增到至少109拷贝。该报道还验证了LAMP技术同时适用于RNA为模板的情况，添加反转录酶与DNA聚合酶共同作用即可。2002年，Nagamine等［2］发现多增加一对环引物（LF、LB）可以加速LAMP反应进程，其中LF位于模板F1c区和F2c区之间，而LB位于B1c区和B2c区之间。

LAMP技术自发明以来，在动植物病原微生物检测、动物胚胎性别确定以及转基因食品检测等多个领域都有了进一步的应用。其中在猪病诊断方向，2005年，Thekisoe等［3］率先使用LAMP方法对实验感染猪的伊氏锥虫进行了检测。2006年，Dukes等［4］建立了检测口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）的RT-LAMP方法。同年，Toriniwa等［5］建立了用于检测日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus， JEV）的实时定量RTLAMP方法。2008年，Blomström等［6］建立了猪水泡病病毒（Swine vesicular disease virus， SVDV）的一步法RT-LAMP。同年，中国农业科学院兰州兽医研究所的Chen等［7-8］分别建立了检测PCV2 的LAMP和高致病性PRRSV的RT-LAMP快速诊断方法；另外一名国内学者En［9］建立了检测PRV 的LAMP方法。2009年，Chen［10-11］又分别建立了检测猪瘟病毒（Classical swine fever virus， CSFV）的RT-LAMP和检测PPV的LAMP方法。2010年，鑫婷等［12］建立了检测猪呼吸与繁殖综合症病毒的RT-LAMP方法。2013年，申世川等［13］建立了检测猪圆环病毒2型（porcine circocirus type 2，PCV-2）的LAMP方法。2014年，张莉等［14］建立了检测猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）的LAMP方法。同年， 李彬等［15］建立了检测猪Hoko virus 的LAMP方法。2015年，时建立等［16］建立了检测猪霍乱沙门氏菌的LAMP方法。

LAMP还可与其他技术结合，发展出一系列的检测方法。2003年，Maruyama等［17］研发出原位LAMP技术，成功检测了大肠杆菌O157： H7中的stx2基因。与原位PCR技术相比，该法对细胞的损伤更小。2004年，Hataoka等［18］将LAMP与聚甲基丙烯酸甲酯电泳芯片结合应用于基因检测方向。同年，Fukuta等［19］建立了免疫捕捉反转录LAMP技 术（Immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification， IC/RTLAMP），用于检测菊花中的番茄斑萎病毒，此法比同时应用的IC/RT-PCR灵敏100倍以上。2006年，国内学者申建维［20］率先建立了多重LAMP检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA和种特异性基因femA的方法，利用两类分子信标荧光探针分别与两种待测基因扩增产物结合，检测两者的荧光值。2007年，Iseki等［21］通过在引物中添加限制性内切酶酶切位点建立的多重LAMP方法，用以鉴别检测牛巴贝斯焦虫和双芽巴贝斯焦虫。2013年，史亚东等建立了检测隐孢子虫的LAMP方法。

4　小结

LAMP技术是一种新型核酸扩增技术。与其他检测方法相比该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增高效快速、步骤简单、鉴定简便等优点。但LAMP技术也有缺点，它的原理较为复杂，特别是引物的设计相当专业；由于敏感性高，假阳性困扰结果的判定，无法做多重扩增；在定量能力方面不如荧光定量PCR等。随着对LAMP研究的深入，该技术将进一步优化完善，LAMP技术将会在病原微生物检测方面发挥越来越重要的作用。

参考文献：

［1］ Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loopmediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acids Res，2000，28（1）：63.

［2］ Nagamine K， Hase T， Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers［J］. Mol Cell Probes，2002，16（3）：223-229.

［3］ Thekisoe O M， Inoue N， Kuboki N， et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification （LAMP），PCR and parasitological tests for detection of Trypanosoma evansi in experimentally infected pigs ［J］.Vet Parasitol，2005，130（3）：327-330.

［4］ Dukes J P， King D P， Alexandersen S. Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus［J］.Arch Virol，2006，151（6）：1093-1106.

［5］ Toriniwa H， Komiya T. Rapid detection and quantification of Japanese encephalitis virus by real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification［J］.Microbiol Immunol，2006，50（5）：379-387.

［6］ Blomström A L， Hakhverdyan M， Reid S M， et al. A one-step reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay for simple and rapid detection of swine vesicular disease virus［J］.J Virol Methods，2008，147（1）：188-193.

［7］ Chen H T， Zhang J， Sun D H， et al. Rapid detection of porcine circovirus type 2 by loop-mediated isothermal amplification［J］.J Virol Methods，2008，149（2）：264-268.

［8］ Chen H T， Zhang J， Sun D H， et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Virol Methods，2008，153（2）：266-268.

［9］ En F X， Wei X， Jian L， et al. Loop-mediated isothermal amplification establishment for detection of pseudorabies virus［J］.J Virol Methods，2008，151（1）：35-39.

［10］ Chen H T， Zhang J， Ma L N， et al. Rapid pre-clinical detection of classical swine fever by reverse transcription loopmediated isothermal amplification［J］.Mol Cell Probes，2009，23（2）：71-74.

［11］ Chen H T， Zhang J， Yang S H， et al. Rapid detection of porcine parvovirus DNA by sensitive loop-mediated isothermal amplification［J］.J Virol Methods，2009，158（1）：100-103.

［12］ 鑫婷，侯绍华，贾红，等. 猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立［J］.中国农业科学，2010（1）：1.

［13］ 申世川，王一成，袁秀芳，等.猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立［J］.浙江农业学报，2013（1）：20.

［14］ 张莉，鄢明华，李秀丽，等.猪流感病毒LAMP检测方法的建立［J］.中国畜牧兽医，2014（7）：30.

［15］ 李彬，杜露平，何孔旺，等.猪Hokovirus LAMP检测方法的建立及应用［J］.西南农业学报，2014（2）：40.

［16］ 时建立，彭喆，郭立辉，等.猪霍乱沙门氏菌LAMP检测方法的建立与应用［J］.中国动物检疫，2015（8）：22.

［17］ Maruyama F， Kenzaka T， Yamaguchi N， et al. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loop-mediated isothermal amplification［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69（8）：5023-5028.

［18］ Hataoka Y， Zhang L， Mori Y， et al. Analysis of specific gene by integration of isothermal amplification and electrophoresis on poly （methyl methacrylate） microchips［J］. Anal Chem，2004，76（13）：3689-3693.

［19］ Fukuta S， Ohishi K， Yoshida K， et al. Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of tomato spotted wilt virus from chrysanthemum［J］.J Virol Methods，2004，121（1）：49-55.

［20］ 申建维，王旭，范春明，等.多重分子信标环介导等温扩增快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌［J］.中华医院感染学，2006，16（7）：729-733.

［21］ Iseki H， Alhassan A， Ohta N， et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification （mLAMP）method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites［J］.J Microbiol Methods，2007，71（3）：281-287.

（责任编辑：杜宪）

Research Progress of Loop Mediated Isothermal Amplification Technology

Song Yucai1，Wang Bin1，Wang Guanxiao1，Li Peng2，Liu Hongming1，Yu Xiaoyun1，Yu Xiaochuan1，Xu Xiaojing1，Wang Junqing1
（1.Yantai Animal Health Supervision Institution，Yantai，Shandong 264003；2. Longquan Veterinary Station，Yantai，Shandong 264003）

Abstract：Loop-mediated isothermal amplification（LAMP） is an amplification method developed by Notomi et al and has been applied successfully for the detection of many viruses，with advantages of amplifying specific DNA under 63～65℃，observing results within an hour. LAMP technology principle and its development status were introduced in this paper.

Key words：LAMP；principle；development status

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X2016-06-0060-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.018