不同频率电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和海马突触的影响

王颖，李威，张亢亢，王慧，孔立红



不同频率电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和海马突触的影响

王颖，李威，张亢亢，王慧，孔立红

［摘要］目的探讨不同频率电针对阿尔茨海默病（AD）大鼠学习记忆能力和大脑海马组织突触形态学和突触密度的影响。方法48只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组、2Hz电针治疗组、30Hz电针治疗组、50Hz电针治疗组，每组8只。以双侧脑室注射Aβ1-42诱导建立AD模型，假手术组双侧脑室注射0.9%氯化钠。2Hz、30Hz、50Hz电针组大鼠选百会、肾俞进行电针治疗14d。采用Morris水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力，透射电镜观察海马突触的超微结构，统计突触密度。结果各电针治疗组与模型组比较，逃避潜伏期明显缩短（P＜0.01），首次跨越平台的时间明显缩短（P＜0.01），跨越平台次数明显增加（P＜0.01），以50Hz电针治疗组为著。各电针治疗组与模型组比较，海马CA1区突触数目明显增多，突触密度明显增大（P＜0.01）。与2Hz、30Hz电针治疗组比较，50Hz电针治疗组突触数目明显增多（P＜0.01）。结论电针能够改善AD大鼠的学习记忆能力，提高海马的突触密度，高频电针治疗效果优于低频、中频。

［关键词］阿尔茨海默病；电针；频率；学习记忆能力；突触密度；大鼠

［本文著录格式］王颖，李威，张亢亢，等.不同频率电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和海马突触的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（6）：635-639.

CITED AS：Wang Y，Li W，Zhang KK，et al.Effect of electroacupuncture with different frequencies on learning and memory ability and synapse in hippocamp in rats with Alzheimer's disease［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：635-639.

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种老年人常见的中枢神经系统变性疾病，早期临床表现为记忆力减退、轻度认知功能障碍［1］。突触是神经系统信息传递和加工的重要环节，突触损伤和丢失是AD患者最早出现的病理变化［2］。越来越多的证据表明AD早期出现的轻度认知功能下降与突触功能障碍相关［3-5］。本研究分别设立低频、中频、高频三组不同频率电针，选取百会、肾俞穴对AD模型大鼠进行针刺治疗，运用Morris水迷宫测试对AD大鼠进行行为学检测，在透射电镜下观察各组大鼠海马突触密度的变化，探讨不同频率电针防治AD大鼠突触损伤的机制，为电针治疗AD提供临床依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

SPF级健康雄性Wistar大鼠48只，3～4月龄，体质量300～350g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。实验前将大鼠适应性喂养1周，动物房温度控制在（22±2）℃，湿度维持在55%左右。

大鼠适应性喂养1周后进行Morris水迷宫学习训练。参照文献方法［6］，实验前将大鼠放置在安全平台上15s，然后分别从第1象限到第4个象限中点放入水中，依次游完4个象限为训练1次，电脑记录其在120s内找到水下实验平台的时间，每训练3次后测试1次，在120s内未找到目标平台的大鼠则被认为智力异常，予以剔除。

按随机数表法将Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、2Hz电针治疗组、30Hz电针治疗组、50Hz电针治疗组，每组各8只。

1.2实验仪器与实验试剂

DW-5大鼠脑立体定位仪：成都泰盟科技有限公司。Morris水迷宫系统：成都泰盟科技有限公司。28 号1寸不锈钢毫针：苏州医疗用品厂。HANS-100A韩式电针仪：南京济生医疗科技有限公司。HT7700透射电镜：日本日立公司。EMUC7切片机：德国莱卡公司。大鼠β样淀粉样蛋白Aβ1-42：美国SIGMA公司。

1.3模型制作

按照O'hare方法［7］制备模型。实验前大鼠称重，用10%水合氯醛0.3g/kg腹腔注射麻醉，在无菌条件下，用脑立体定位仪固定大鼠，按照《大鼠脑立体定位图谱》［8］选择大鼠海马区齿状回，前囟后3.2mm，中线左右各旁开2.5mm，深度3.5mm，用牙科钻在大鼠颅骨上钻孔。用磷酸盐缓冲液将Aβ1-42配制成浓度为1μg/μl的溶液，37℃孵育1周后成为寡聚肽，用5 μl微量注射器缓慢将Aβ1-42注入海马齿状回，双侧分别注射5 μl，以1 μl/min的速度注射，5min内注完，留针5min让药物充分吸收。牙托粉封闭颅骨钻孔，缝合皮肤，碘酒消毒。

假手术组处理方法同模型组，双侧齿状回区注射生理盐水5 μl。造模完成大鼠连续3d腹腔内注射青霉素4×104U，预防大鼠感染。

1.4方法

造模15d后，电针治疗组选取百会（顶骨正中）和肾俞（腰椎下两旁2穴）进行针刺，百会向前平刺5mm，肾俞稍向内斜刺5mm，然后接韩式电针仪，百会接负极，肾俞接正极，左右侧肾俞每日交替使用。2Hz电针治疗组：频率2Hz，电压2～4 V，电流1～2 mA，选用连续波，每次治疗留针20min左右，每天1次，7d为1个疗程，疗程间休息1d，共治疗2个疗程。30Hz电针治疗组和50Hz电针治疗组：操作方法同2Hz电针治疗组，仅针刺频率不同。

1.5Morris水迷宫测试

治疗2个疗程结束后采用Morris水迷宫视频分析系统，通过定位航行实验和空间探索实验检测大鼠行为记忆能力。

定位航行实验。平台位于第3象限中间，距离水面1cm，将大鼠面向池壁分别从4个象限放入水中各1次，记录其在120s内找到隐藏在水面以下平台的时间，记录为逃避潜伏期；若120s内未找到平台者则将其引至平台停留10s，记录逃避潜伏期为120s。

空间探索实验。去除平台后，将大鼠从原平台象限的对侧象限放入水中，连续记录其在120s的游泳轨迹，在平台象限逗留时间和跨越平台象限次数。数据采集和处理由图像自动监视和处理系统完成。

1.6电镜下观察海马CA1区突触形态和数目

1.6.1灌注与取材

各组Morris水迷宫试验完成后进行灌注取材。10%水合氯醛45mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于试验台上，在剑突下打开胸腔，暴露心脏，从左心室插入灌流针并固定，用生理盐水200ml灌注冲洗体内血液，剪开右心耳，冲洗至大鼠眼球、口腔黏膜及肝脏组织泛白，后用4%多聚甲醛300ml快速灌注直至大鼠肢体及内脏组织僵硬为止。大鼠断头后快速剥离颅骨，分别取出大小为1mm3海马CA1区组织，放入2.5%戊二醛固定液中固定保存，用于电镜样品制备。

1.6.2电镜样品的制作和观察

戊二醛固定后用0.lmol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次10min，将标本置入1%四氧化锇中固定1h。0.lmol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次10min，后再分别用浓度为50%、70%、80%、90%的丙酮脱水20min；Epon812组织渗透，平板包埋后在光镜下定位取材，切片机将包埋块切成50nm超薄切片，用2%醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色。在透射电子显微镜下进行突触计数。取5000倍，避开大的树突干、血管和各种细胞体，在整个切片上下左右分别选取5个点进行摄片。电镜摄片面积为5.6×6.0 μm2，切片厚度为50nm，即为观察1.68 μm3的突触数目，在电镜照片上辨认和计数突触终末，计算单位面积神经毡内突触数量。

1.7统计学分析

2　结果

2.1Morris水迷宫测试

模型组与正常组、假手术组比较逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），首次跨越平台的时间明显延长（P＜0.01），跨越平台次数明显减少（P＜0.01）。电针治疗组与模型组比较逃避潜伏期明显缩短（P＜0.01），首次跨越平台的时间明显缩短（P＜0.01），跨越平台次数明显增加（P＜0.01）。50Hz电针治疗组与2Hz电针治疗组、30Hz电针治疗组比较，逃避潜伏期明显缩短（P＜0.01），首次跨越平台的时间缩短（P＜0.05），跨越平台次数增加（P＜0.05）。2Hz电针治疗组、30Hz电针治疗组逃避潜伏期比较无显著差异（P=0.710），首次跨越平台时间比较无显著性差异（P=0.821），跨越平台次数比较无显著性差异（P=0.603）。见表1、表2。

2.2各组大鼠海马CA1区突触电镜结果

2.2.1海马CA1区突触超微结构的观察

正常组、假手术组神经毡内可见大量突触，突触轮廓完整，分界清楚，突触小泡分布密集均匀。模型组神经毡突触数目明显减少，突触轮廓不完整，突触间隙模糊，突触前膜、后膜不清晰、变薄，突触小泡明显减少，甚至消失，典型的突触结构消失。2Hz电针治疗组、30Hz电针治疗组可见较多突触，突触前膜内的突触小泡也较多。50Hz电针治疗组可见突触前终末的突触小泡密集分布，较多圆形清亮小泡，突触前、后膜较模型组、假手术组增厚。见图1。

2.2.2突触密度

与正常组相比，假手术组神经毡内突触密度无显著性差异（P=0.540），模型组大鼠海马突触密度明显减小（P＜0.01）。与模型组比较，电针治疗组突触密度较模型组明显增大（P＜0.01），2Hz和30Hz电针组突触密度无显著性差异（P=0.918）。50Hz电针组突触数目较2Hz电针组和30Hz电针组明显增多（P＜0.01）。见表3。

表1　各组定位航行实验平均逃避潜伏期比较（s）

表2　各组空间探索实验首次跨越平台时间、跨越次数比较

表3　各组海马CA1区神经毡内突触密度比较（/1.68 μm3）

图1　电镜下海马CA1区的突触形态和突触数目（透射电镜，5000×）

3　讨论

AD是痴呆最常见的类型，病理特征为老年斑、神经元纤维缠结，海马锥体细胞空泡样变性，神经元缺失和轴索、突触的异常断裂等［1，9］。突触是神经元之间连接的基础，也是神经信息传递的关键部位。只有保持突触结构和功能的完整，才能使神经元彼此之间顺利进行信息传递、加工和存储。Selkoe发现AD是寡聚态的Aβ沉积导致突触功能障碍，突触密度是脑组织和结构的重要指标［10］。有学者认为AD患者的认知水平与海马以及联合皮质的突触密度密切相关［11］。本研究将Aβ1-42定位注射于海马齿状回，电镜下观察到模型组海马CA1区神经毡突触数目明显减少，突触轮廓不完整，突触间隙模糊，典型的突触结构消失，突触密度明显下降。这与Selkoe等的研究结果［9］相一致。

AD患者脑内突触的减少可能由于Aβ寡聚体选择性的积聚于突触部位，引起突触膜蛋白、突触囊泡蛋白的表达减少，损伤突触内蛋白、树突棘形态和密度，导致突触数量的减少和突触密度的下降，破坏神经元之间的联系，引起认知和记忆障碍［12-15］。

中医认为AD为肾气不足、髓海空虚所致。记忆功能与肾中的精气功能密切相关，肾气充足则脑髓充实，才能正常的思维、学习和记忆。肾俞位于背部属于足太阳膀胱经，与足少阴肾经为表里经。督脉与脑的联系最直接、密切。百会位于人之颠顶，属督脉，为手足三阳、督脉之汇，具有醒脑开窍、补脑益智之功，是治疗脑病的要穴［16］。百会、肾俞两穴合用共奏醒脑开窍，益肾调督，激活脏腑功能，从而改善其精神及运动功能。罗磊等发现针灸肾俞、关元穴能有效抑制海马神经元线粒体中Aβ-结合性乙醇脱氢酶蛋白（ABAD）的过度表达，提高细胞色素氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性，从而减轻海马神经元的损伤［17］。崔翔等发现益肾调督针灸法有效地抑制海马线粒体CypD表达，从而阻滞线粒体通透性转换孔的形成，减少线粒体损伤。以上研究均证实益肾调督针刺法对于AD具有良好的疗效［18］。

针灸治疗疾病，具有整体、良性的调节作用，且安全性高。电针治疗AD的临床疗效确定。频率是电针刺激的重要参数之一。张超等发现电针治疗大脑中动脉闭塞大鼠，针刺组与模型组、非针刺组相比较，脑血流量与神经行为学评分均有不同程度提高，尤其是针刺频率为3次/s时，脑血流量和神经行为学评分的改善最显著［19］。欧阳钢等发现电针治疗脑卒中患者疗效与不同针刺频率有关，与2Hz比较，100Hz频率针刺更能提高其脑血流量，改善脑细胞功能［20］。这说明针刺的频率与疗效有密切关系。因此本实验运用不同频率电针进行治疗干预，结果表明2Hz、30Hz、50Hz电针组均能有效地改善AD大鼠学习记忆能力，且50Hz电针治疗组优于30Hz、2Hz电针治疗组。透射电镜下观察，各组AD大鼠海马的突触数目增加，尤其是50Hz治疗组，与AD大鼠行为学测试结果基本一致。

本研究说明电针可以明显改善AD大鼠的空间学习能力和记忆水平，高频电针组治疗效果优于低频电针组。高频电针将较强刺激信号传导至大脑，提高大脑血流灌注量，启动机体的自身调节功能，清除脑内β样淀粉样蛋白，激活Wnt信号通路，从而使沉默突触复苏和修复、再生，增加突触数目，提高海马组织的突触密度，改善AD大鼠的学习记忆水平。更多深层次的机制有待于进一步研究。

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Effect of Electroacupuncture with Different Frequencies on Learning and Memory Ability and Synapse in Hippocamp in Rats with Alzheimer's Disease

WANG Ying，LI Wei，ZHANG Kang-kang，WANG Hui，KONG Li-hong

Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan，Hubei 430061，China

Correspondence to KONG Li-hong.E-mail：xiyu1618@sina.com

Abstract：Objective To observe the effect of electroacupuncture with different frequencies on learning and memory ability，synaptic morphology and synaptic density in the hippocampus of Alzheimer's disease rats.Methods Forty-eight healthy Wistar rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group，2Hz，30Hz and 50Hz electroacupuncture groups with 8 cases in each group.The Alzheimer's disease model was established by injecting Aβ1-42into two sides of lateral cerebral ventricle.The sham operation group was injected with normal saline instead.The electroacupuncture groups received electroacupuncture at Baihui（DU20）and Shenshu（BL23）acupoints.The learning and memory ability was evaluated with Morris water maze test，and the morphology and density of synapse were observed by electron microscope.Results Compared with the model group，the latency was shorter，the time of crossing the platform was shorter and the number of crossing the platform was more in the electroacupuncture groups（P＜0.01），especially in the 50Hz electroacupuncture group（P＜0.01）.The number of synapse and the synaptic density were more in the electroacupuncture groups than in the model group（P＜0.01），especially in the 50Hz electroacupuncture group（P＜0.01）.Conclusion Electroacupuncture could improve learning and memory ability and increase synaptic density in rats with Alzheimer's disease，especially with high frequency.

Key words：Alzheimer's disease；electroacupuncture；frequency；learning and memory ability；synaptic density；rats

［中图分类号］R749.1

［文献标识码］A

［文章编号］1006-9771（2016）06-0635-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.003

基金项目：国家自然科学基金项目（No.81373741）。

作者单位：湖北中医药大学，湖北武汉市430061。

作者简介：王颖（1981-），女，湖南涟源市人，博士研究生，主要研究方向：针灸防治脑病。通讯作者：孔立红（1960-），女，教授，博士生导师，主要研究方向：针灸防治脑病。E-mail：xiyu1618@sina.com。

收稿日期：（2016-03-28修回日期：2016-05-17）