人参皂苷Rg1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

李锋涛，林磊，程斌



·基础研究·

人参皂苷Rg1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

李锋涛1，林磊2，程斌1

［摘要］目的探索人参皂苷Rg1对于大鼠脊髓缺血再灌注损伤（SCII）后细胞凋亡的影响。方法成年健康Sprague-Dawley大鼠48只，随机分为假手术组（n=8）、缺血组（n=8）、再灌注组（n=16只）和药物组（n=16）。假手术组仅安放球囊不阻断血流；缺血组脊髓缺血30min；药物组大鼠分别于脊髓缺血前30min及术后腹腔注射人参皂苷Rg1 30mg/kg；再灌注组与药物组相同时间点注射相同体积生理盐水。假手术组、缺血组于缺血后30min，药物组和再灌注组于再灌注后6h及24h应用HE染色检测细胞形态改变，应用免疫组织化学染色检测Bcl-2及survivin表达。结果缺血组、再灌注组及药物组HE染色均有神经元损伤，药物组损伤较其他两组明显减轻。缺血组、再灌注组和药物组survivin、Bcl-2阳性细胞明显高于假手术组（t＞3.896，P＜0.01）。药物组6h、24h survivin及Bcl-2蛋白阳性细胞均较再灌注组显著增加（t＞6.693，P＜0.001）。结论人参皂苷Rg1可减少早期大鼠SCII后神经元损害，增加抗凋亡蛋白survivin、Bcl-2的表达，抑制凋亡。

［关键词］脊髓损伤；缺血再灌注损伤；人参皂苷Rg1；凋亡；大鼠

［本文著录格式］李锋涛，林磊，程斌.人参皂苷Rg1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（6）：650-654.

CITED AS：Li FT，Lin L，Cheng B.Effect of Ginsenoside Rg1 on apoptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：650-654.

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII）是由于脊髓局部缺血，引起兴奋性氨基酸毒性作用、大量氧自由基生成和脂质过氧化，导致多种炎性介质释放、神经细胞变性、坏死和程序性凋亡的复杂过程。其中，神经细胞凋亡越来越被重视。人参皂苷Rg1是人参皂苷最主要的活性成分之一［1］，具有抗氧化、抗细胞凋亡、提高免疫力、减少细胞肿胀等作用。研究显示人参皂苷Rg1能明显减轻肾、脑等脏器缺血再灌注损伤［2］，但在SCII方面报道较少。本实验旨在观察人参皂苷Rg1对于SCII后神经细胞凋亡的影响，探讨其在临床中的意义。

1　材料与方法

1.1主要仪器及试剂

survivin及Bcl-2大鼠单克隆抗体：美国SANTACRUZ公司。SP免疫组化试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司。Fogarty导管：美国EDWARDS LIFESCIENCES公司。图像信号采集与分析系统（Q500IW）：德国LEICA公司。

1.2动物分组

成年健康清洁级Sprague-Dawley大鼠48只，体质量（209±16）g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。将动物编号后，按随机数字表法分为假手术组（n=8）、缺血组（n=8）、再灌注组（n=16）和药物组（n=16）。

1.3造模

所有动物术前禁食12h，不禁水。3%苯巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉。显露左侧颈总动脉及尾动脉，置入与监护仪连接的PE50导管，监测近、远端血压（近端导管连接放血装置）。暴露左侧股动脉，将2F Fogarty导管置入10.8～11.4cm，使得球囊位于左锁骨下动脉分支处。充盈球囊，阻断胸主动脉，同时立即通过放血装置开始放血，将近端平均动脉压维持在45 mmHg。30min后，放松球囊，恢复胸主动脉血流，将所放出的血液匀速回输。术后皮下注射硫酸鱼精蛋白4mg。将动物置于25～30℃的保温箱内，等待动物苏醒后放回饲养笼中。

假手术组仅安放球囊不阻断血流。

1.4方法

药物组大鼠脊髓缺血前30min腹腔注射人参皂苷Rg1 30mg/kg，术后腹腔注射人参皂苷Rg1 30mg/ kg。再灌注组相同时间点注射相同体积生理盐水。术后所有大鼠均在SPF清洁级实验室内饲养，自由进食及饮水。整个实验过程中各组死亡的动物分别在相同条件下予以补充。

1.5标本采集

假手术组，缺血组于缺血后30min，药物组和再灌注组于再灌注后6h（n=8）及24h（n=8）行4%多聚甲醛灌注后取出标本进行石蜡包埋，于L3节段2mm范围内连续切片，厚度为10 μm。

1.6HE染色

各组动物分别于缺血后及再灌注6h、24h分别进行HE染色，观察各组脊髓内细胞形态变化。切片在二甲苯I、二甲苯Ⅱ中各脱蜡10min；无水乙醇2min，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇各1min，蒸馏水洗2min；苏木素5min，清水冲洗；0.5%盐酸乙醇（70%乙醇配制）分化，提插数下，清水浸泡15min；0.5%伊红染液染色2min；80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及无水乙醇中各1min；二甲苯透明2次，各5min，中性树脂封片。光镜下观察。

1.7免疫组织化学染色

各组动物分别于缺血后及再灌注6h、24h分别进行损伤区脊髓组织Bcl-2及survivin染色，观察各组脊髓内Bcl-2及survivin表达量变化。二甲苯透明，梯度乙醇脱水，3%H2O2去离子水孵育30min，5%BSA封闭液封闭20min。滴加小鼠抗大鼠survivin/Bcl-2一抗（1：200），湿盒4℃孵育过夜，滴加生物素化二抗工作液，室温孵育20min。滴加SABC，室温孵育15min。DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明；中性树脂封片。所有切片均应用LEICA Q500IW图像信号采集与分析系统进行图像采集处理，每只动物观察3张切片，每张切片随机取5个视野，取平均值。

1.8统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行数据分析。两组数据比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1HE染色

假手术组脊髓组织神经细胞饱满，胞浆内尼氏体清晰，细胞核边界清楚，核仁清晰可见。缺血组神经细胞皱缩，尼氏体模糊，细胞核边界及核仁不清，神经细胞数量减少。再灌注组再灌注6h后神经细胞继续皱缩，胞浆及细胞核结构不清，尼氏体模糊，细胞数量减少；24h后神经细胞数量显著减少，胞体皱缩，细胞核及尼氏体等结构不清，脊髓组织出现空泡。药物组不同时间点均可见类似损伤性改变，但同再灌注组各亚组相比，损伤程度明显较轻。见图1。

2.2免疫组织化学染色

survivin及Bcl-2蛋白表达于胞浆。假手术组脊髓组织survivin、Bcl-2基本不表达。缺血组、再灌注组和药物组survivin、Bcl-2阳性细胞明显高于假手术组（P＜0.01）。药物组6h、24h survivin及Bcl-2蛋白阳性细胞均较再灌注组显著增加（P＜0.001）。见表1、表2、图2、图3。

3　讨论

SCII后，脊髓组织由于缺血缺氧、能量代谢障碍、多种炎性因子释放［3-5］、活性氧族生成、Ca2+大量内流等，均可激活细胞凋亡信号通路，引起神经细胞的凋亡［6］。研究证实哺乳动物细胞凋亡主要通过两条途径［7］，外源性凋亡配体途径的激活需要配体与所谓的细胞表面的死亡受体相结合，从而激活caspase-8［8］。内源性途径可被代谢、基因等其他因素所激活，导致线粒体完整性被破坏及线粒体通透性改变，该过程导致细胞色素C释放［9］，从而激活起始因子caspase-9。无论哪种刺激，最终会激活起始caspases，使其下游caspases活性增高，导致凋亡［10］。

人参皂苷Rg1是从人参中提取的有效活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［11-14］。其可通过抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK）的磷酸化而阻断JNK通路，减少线粒体损伤及抑制凋亡［15-16］；抑制细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）的表达，减少炎性反应；同样也对肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α诱导的丝裂活化蛋白激酶激酶4（Mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）的磷酸化及JNK-AP-1通路的激活有抑制作用［17］。王淑秀等发现人参皂苷Rg1可抑制帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元EphB1、P-c-Jun蛋白表达，提高酪氨酸羟化酶表达，抑制神经元凋亡，改善神经功能［18］。黄天文等应用人参皂苷Rg1处理寡聚肽Aβ1-42诱导的神经元凋亡过程，发现人参皂苷Rg1可通过JNK信号通路减轻寡聚肽Aβ1-42诱导的神经元凋亡［19］。在肾缺血再灌注损伤中，人参皂苷Rg1通过抑制Bax的表达抑制细胞的凋亡［20］。袁琼兰等发现人参皂苷Rg1通过促进凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP）的表达来抑制脑神经细胞的凋亡［21］。亦有报道证实人参皂苷Rg1可调节ERK1/2和p-JNK的表达，减少脑缺血再灌注损伤后海马区神经元凋亡［22］。人参皂苷Rg1是否在SCII中同样具有抑制神经细胞凋亡的作用罕见报道。

表1　不同组别及各时间节点脊髓组织survivin平均灰度值（n=8）

表2　不同组别及各时间节点脊髓组织Bcl-2平均灰度值（n=8）

图1　各组脊髓组织HE染色（400×）

图3　各组脊髓组织Bcl-2表达（免疫组化染色，400×）

Bcl-2是细胞内重要的抗凋亡蛋白，是线粒体介导的凋亡途径中细胞内关键的检查点，可通过抑制促凋亡蛋白介导的凋亡［23-24］，保持线粒体膜的完整性，阻止线粒体膜通透性孔（permeability transition pore，PT孔）开放，减少细胞色素C、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等释放，而抑制细胞的凋亡。survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）中最小的成员［25］，包括142个氨基酸，survivin蛋白N-端的杆状病毒细胞凋亡抑制蛋白重复序列（BIR）结构域可以通过抑制procaspase-3和procaspase-7或直接抑制激活的caspase-3和caspase-7的活性来发挥抑制凋亡的作用。

本实验采用大鼠SCII模型，在缺血损伤30min，再灌注损伤后6h、24h时观察人参皂苷Rg1神经细胞形态、Bcl-2及survinin表达水平。结果显示，与再灌注组比较，药物组在再灌注损伤6h、24h时神经细胞的变性、皱缩、脊髓组织中空泡形成等病理变化明显减轻；而神经元胞体内Bcl-2及survivin表达水平，显著高于其他各组。以上结果提示，通过上调Bcl-2及survinin的表达，稳定线粒体膜，减少细胞色素C、AIF等的释放，抑制precaspases家族的激活，可能是人参皂苷Rg1发挥抗凋亡作用的机制之一。

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Effect of Ginsenoside Rg1 on Apoptosis after Spinal Cord Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LI Feng-tao1，LIN Lei2，CHENG Bin1

1.Department of Orthopedics，the 2nd Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shaanxi 710004，China；2.Department of Orthopedics，the Hanzhong Central Hospital，Hanzhong，Shaanxi 723000，China

Correspondence to CHENG Bin.E-mail：drcheng2006@sina.com

Abstract：Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1 on apoptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury（SCII）in rats.Methods Forty-eight adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group（n=8），ischemia group（n=8），ischemia-reperfusion group（n=16）and drug group（n=16）.Fogarty catheter was put in the thoracic aorta of the rats and the blood flow wasn't blocked in the sham group.The rats in the ischemia group were sacrificed 30 minutes after spinal cord ischemia.The drug group was injected with ginsenoside Rg1 30mg/kg 30 minutes before and after SCII.The same volume of normal saline was injected in the ischemia-reperfusion group at the same time.The expression of Bcl-2 and survivin was detected with immunohistochemistry at six hours，24 hours after reperfusion in the ischemia-reperfusion group and drug group，30 minutes after ischemia in the ischemia group and in the sham group.The change of cells was observed in each group with HE staining.Results The cells were damaged in the ischemia group，the ischemia-reperfusion group and the drug group，in which the drug group was better than the other groups.The expression of survivin and Bcl-2 was higher in the ischemia group，the ischemia-reperfusion group and the drug group than in the sham group（t＞3.896，P＜0.01），and were significantly higher six hours and 24 hours after reperfusion in the drug group than in the reperfusion group（t＞6.693，P＜0.001）.Conclusion Ginsenoside Rg1 can reduce the neurons damage and increase the expression of the Bcl-2 and survivin，that inhibit cells apoptosis after SCII in rats.

Key words：spinal cord injury；ischemia-reperfusion injury；ginsenoside Rg1；apoptosis；rats

［中图分类号］R743.3

［文献标识码］A

［文章编号］1006-9771（2016）06-0650-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.006

基金项目：陕西省自然科学基金面上项目（No.2014JM2_8157）。

作者单位：1.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西西安市710004；2.汉中市中心医院，陕西汉中市723000。

作者简介：李锋涛（1980-），男，汉族，陕西兴平市人，博士，主治医师，主要研究方向：脊柱外科。通讯作者：程斌（1961-），男，汉族，陕西兴平市人，博士，教授，主要研究方向：脊柱外科。E-mail：drcheng2006@sina.com。

收稿日期：（2015-11-16修回日期：2016-01-22）