嗜热厌氧梭菌27405直接发酵造纸污泥产氢特性

瞿晓苏，汤虹，朱明军

(华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 广东，510006)



嗜热厌氧梭菌27405直接发酵造纸污泥产氢特性

瞿晓苏，汤虹，朱明军*

(华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 广东，510006)

摘要造纸污泥含有大量纤维素和半纤维素，能被纤维素降解菌直接利用。嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)能利用不同来源的木质纤维素生产氢气。为评价C.thermocellum直接发酵造纸污泥产氢特性，研究了接种量、尿素浓度、酵母提取物浓度和底物浓度对产氢的影响。结果表明:当C.thermocellum接种量为7%、培养基中尿素浓度为15 μg/L、酵母提取物质量浓度为5 μg/L及造纸污泥质量浓度为20 μg/L时，氢气产量最高，为110.61 μmmol/L。造纸污泥相对于其他木质纤维素原料具有明显的产氢优势。

关键词热纤梭菌;发酵;造纸污泥;产氢

近年来，环境污染的威胁、全球能源需求的增长及能源的愈发短缺加速了人们寻找新的可再生清洁能源的步伐。氢气是一种零污染物排放的可再生能源，其完全燃烧仅产生水。与汽油相比，氢气具有更高的热值，每克氢气完全燃烧时所放出的热量为122 kJ[1]，因此氢气作为替代燃料开发潜力巨大。氢气可以在燃料电池和内燃机中使用，研究指出，在天然气中加入10%氢气将显著减少温室气体排放[2]。相对于热化学制氢和电化学制氢，发酵法生物制氢过程耗能少且成本低，备受世人关注。发酵法生产氢气的经济可行性很大程度上取决于以有机废物或废水为原料的可用性，现今大多数原材料来源于农业废弃物[2-3]，多数原料需要进行预处理，增加了氢气的生产成本。

造纸污泥是制浆造纸废水生化处理过程的固体残渣。2009年，中国产生9.982×106t 80%含水量的造纸污泥，居世界首位，且将以10%的增长率逐年增加[4]。在制浆造纸过程中，原料中的大部分纤维质被用于生产纸制品，余下的有机质则被转移到废水中，因此造纸污泥中含有丰富的生物质，碳水化合物含量约为50%～70%，其中大约有80%是纤维素和半纤维素[5]，另外还含有一些填料、凝聚剂等。将造纸污泥随意弃置或未经无害化处理容易污染环境，尤其是污染地下水资源，危害人体健康，甚至带来生态危机[6]。由于污泥成分的复杂性，处理的难度大且成本高，如何将造纸污泥进行资源化利用具有重要的现实意义。

嗜热厌氧梭菌(Clostridiumthermocellum)是一种严格嗜热厌氧菌，它能迅速降解纤维素和半纤维素。这种菌在细胞膜表面形成胞外多酶复合物(即纤维小体)，其中包含20种以上的水解酶，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、糖苷酶和脂酶[7]。水解纤维素后，C.thermocellum利用高聚合度的纤维二糖和纤维糊精产生乙醇、氢气、乙酸、乳酸、甲酸和二氧化碳等代谢产物。C.thermocellum能高效水解不同种类的纤维素原料，理论上可以直接利用造纸污泥发酵产氢。本研究以造纸污泥为原料，利用C.thermocellum在不经任何预处理和不加酶的情况下直接发酵造纸污泥，并对其产氢性能进行了研究。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种来源

嗜热厌氧梭菌(ClostridiumthermocellumATCC 27405)由Dartmouth College 的 Lee R. Lynd 教授赠送，保藏于华南理工大学发酵工程研究室。

1.1.2原料

化学制浆污泥(含纤维素57.60%，半纤维素13.41%，灰分12.60%)来自广东某造纸厂。将造纸污泥放入60 ℃烘箱干燥48 h后，使用高速万能粉碎机粉碎后过200目筛，室温存放。

1.1.3主要试剂及仪器

微晶纤维素Avicel® PH-105购自美国FMC BioPolymer公司; G+细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司; qPCR用premix试剂SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa); 其余试剂为进口或国产的分析纯或生化试剂。主要仪器:7500型实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司(ABI)生产。

1.2培养基及培养方法

本研究所用的基本培养基为MTC培养基，主要包括A、B、C、D、E五种培养液。培养基的具体成分详见李平等的研究[8]。培养基5种成分按体积比40∶2∶1∶1∶1用无菌注射器在100 mL血清瓶中混合，每个血清瓶中培养基装液量为45 mL。以10%的接种量(V/V)接入C.thermocellum菌液，于55 ℃、150 r/min的条件下培养84 h作为种子液。

1.3实验方法

1.3.1菌种降解造纸污泥产氢特性研究

在55 ℃、150 r/min的条件下，研究接种量、酵母提取物浓度、尿素浓度和底物浓度对C.thermocellum直接发酵造纸污泥产氢的影响。所有实验在100 mL血清瓶中进行，工作体积为50 mL。以10%的接种量(V/V)接种新鲜种子液，发酵168 h后测定氢气产量、生物量、pH值以及发酵液中产物的分布。为了保证数据的可信度，实验组各设3个平行实验。

1.3.2最优条件下菌种降解造纸污泥产氢

在1.3.1研究的基础上，探索最优条件下C.thermocellum直接发酵造纸污泥产氢特性。以最优浓度的造纸污泥为碳源，配制MTC培养基，其中尿素浓度和酵母提取物浓度按照最优浓度配置，以最优接种量(V/V)接种新鲜菌液，放置于55 ℃、150 r/min的摇床中培养，每24 h取样，连续取样至168 h，测定各瓶中氢气产量、生物量、pH值、底物降解率以及发酵液中产物的分布。底物降解率通过测定发酵前后造纸污泥干重的变化进行计算。

(1)

1.4分析测定方法

1.4.1氢气产量的测定

发酵后血清瓶中H2和CO2浓度通过气相色谱(GC)法分析得出。具体步骤详见之前的研究[9]。

1.4.2发酵液中产物的测定

发酵液中的次级代谢产物(乙醇、乙酸)通过高效液相色谱(HPLC)测定，色谱仪为Waters 1525 Binary HPLC Pump;色谱柱为Aminex HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)，柱温60 ℃;检测器为Waters 2414示差折光检测器 (RID, refractive index detector)，检测器温度为40 ℃。流动相为5 mmol/L H2SO4(超纯水配制)，流速为0.6 mL/min。所有样品在HPLC分析前都必须进行预处理，具体方法详见李平等的研究[8]。

1.4.3细胞生长的测定

生物量按照之前所建立的qPCR方法进行测定[9]。

1.4.4pH的测定

发酵后发酵液的pH值直接用PB-10酸度计进行测定，测定范围为0～14，精度为0.01。

2结果与讨论

2.1不同接种量对菌种直接发酵造纸污泥产氢的影响

发酵初期的菌体浓度可能显著影响菌体生长的延滞期及产物的合成，为研究接种量对C.thermocellum直接发酵造纸污泥产氢的影响，分别以5%、7%、10%、12%和15%的接种量(V/V)接种菌液，168 h后测定各瓶中氢气的产量、生物量、pH值以及发酵液中产物的分布，其结果如图1所示。

图1　在不同的接种量下发酵168 h后得到的发酵产物、生物量和pH变化情况 Fig.1　Effect of inoculum size on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

由图1可以看出，接种量对C.thermocellum直接发酵造纸污泥产氢具有较为明显的影响。当接种量为5%时，发酵液中菌体含量较低，同时，发酵液中纤维素酶的酶解效率较低，不利于菌体利用底物。氢气的产量在接种量为7%时最高，达到41.17 mmol/L(0.59 mmol/g); 随着接种量的继续增加，氢气的产量逐渐下降，这可能是由于接种量较高时，发酵前期菌体生长迅速，同时快速产生有机酸，伴随着发酵液pH的迅速下降。过低的pH一方面抑制菌体的生长，另一方面也抑制了纤维素酶的活力[8]，从而阻碍了菌体的代谢和酶解。另外，种子液的pH约为5.0～5.5，而C.thermocellum生长最适的pH为7.4，接种量越大，发酵液初始pH越低，从而抑制菌体的生长和代谢，进一步抑制发酵产氢。

2.2尿素浓度对菌种直接发酵造纸污泥产氢的影响

ISLAM等[10]在研究中发现，当提高培养基中尿素的浓度时，能同时促进C.thermocellum产生氢气和乙醇。为研究尿素浓度对C.thermocellum发酵造纸污泥的影响，调整MTC培养基中尿素质量浓度分别为0、5、10、15和20 g/L，发酵168 h后测定各瓶中氢气产量、生物量、pH值以及发酵液中产物的分布，其结果如图2所示。

图2　在不同的尿素质量浓度下发酵168 h后得到的发酵产物、生物量和pH变化情况Fig.2　Effect of urea concentration on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

由图2可知，在较低质量浓度范围内，氢气产量随着尿素质量浓度的升高而略微升高，当浓度从0 g/L升高为15 g/L时到达最大值，为37.18 mmol/g，进一步提高尿素质量浓度则使氢气产量下降。与氢气产量不同，乙醇产量随着尿素含量的升高而显著提高，尿素质量浓度为15 g/L时，乙醇产量最高，为25.27 mmol/L，比不添加尿素时提高了210%; 进一步提高尿素质量浓度并没有使乙醇产量继续提高。LIN等[11]指出，产氢微生物活性依赖于碳氮比，合适的碳氮比通过影响微生物的代谢途径从而增强氢气的产量。可以推断，尿素浓度的提高改变了碳氮比，使C.thermocellum发酵产生乙醇的代谢途径显著增强，而C.thermocellum的氢气代谢途径与乙醇代谢途径都属于葡萄糖代谢的分支途径，存在一定的竞争关系，因此当乙醇代谢途径增强时， 往往伴随着氢气代谢途径的减弱。

曾有文献报道，尿素对乙酸的产生起促进作用[12]。也有文献指出，尿素可以与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯(尿烷)，从而降低乙醇浓度[13]。

乙酸产量在低质量浓度范围内随尿素质量浓度的升高而升高，但当尿素质量浓度高于10 g/L时，乙酸产量并没有进一步增加。造成这种现象的原因可能是:尿素的碱性使发酵终pH值随尿素浓度的升高而升高(图2(b))，当尿素含量从0 g/L增加到20 g/L时，发酵终pH值从5.17增加到6.29。

2.3酵母提取物质量浓度对菌种直接发酵造纸污泥产氢的影响

酵母提取物与尿素都属于有机氮源，为微生物生长和产物合成提供营养。尿素对微生物的促进作用仅在于细胞的比生产能力，而酵母提取物则对发酵的各个方面都存在显著的影响[10]。为研究酵母提取物对C.thermocellum生长代谢的影响，调整MTC培养基中酵母提取物质量浓度分别为0、1、3、5和7 g/L，发酵168 h后测定各瓶中氢气产量、生物量、pH值以及发酵液中产物的分布，其结果如图3所示。

据报道，C.thermocellumATCC 27405完全转化1%纤维素时，需要至少0.6%酵母提取物[14];C.thermopalmarium与C.thermocellum共培养的条件下，1 g纤维素底物在添加1 g酵母提取物时达到最高产氢量和底物利用率[15]。另外，酵母提取物除了含有氨基氮外还含有维生素和其他未知生长因子，为微生物生长提供良好的营养源;而C.thermocellum所利用酵母提取物中的功能组分主要是对氨基苯甲酸、VB12、吡哆胺和生物素。这可能是酵母提取物同时对纤维素降解和氢气的生产产生显著促进作用的原因。如图3所示，当酵母抽提物质量浓度从0提高到5 g/L的过程中，氢气的产量随之不断升高，从21.55 mmol/L增加到38.51 mmol/L;同时，发酵结束时细胞量从6.60×108cell/mL上升为21.89×108cell/mL，发酵终点的pH从5.25下降为5.10。然而，进一步提高酵母提取物的浓度，氢气产量有所下降。因此，C.thermocellum在以造纸污泥为碳源时发酵产氢，酵母提取物的最优浓度为5 g/L。

图3　在不同酵母提取物质量浓度下发酵168 h得到的发酵产物、生物量和pH变化情况Fig.3　Effect of yeast extract concentration on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

2.4底物浓度对菌种直接发酵造纸污泥产氢的影响

底物浓度对发酵产物的产量具有显著的影响，工业化生产中常期望提高底物浓度以增大产物的产量。底物浓度过低会增加发酵成本，底物浓度过高则不利于发酵过程的传质传热。为探索造纸污泥最佳浓度，分别以5、10、20和40 g/L的造纸污泥为碳源，测定发酵168 h后各瓶中氢气产量、生物量、pH值以及发酵液中产物的分布，结果如图4所示。

由图4可知，氢气产量随着造纸污泥浓度的增加而上升(图4(a))。当造纸污泥质量浓度达到40 g/L时，氢气浓度达到最大值132.99 mmol/L，为20 g/L造纸污泥浓度时氢气产量的1.41倍。但是40 g/L造纸污泥浓度下的每克底物的氢气产量为3.32 mmol，比20 g/L造纸污泥浓度时每克底物的氢气产量4.72 mmol/L低29%。这说明在高浓度底物条件下，C.thermocellum酶解效率较低。高底物浓度下发酵产物的产量降低的现象在其他文献中也有报道[16]。当底物浓度过高时，由于游离水少，传质传热困难，氢气产量增加放缓，发酵效率下降。底物浓度过高，也将促使血清瓶内挥发性脂肪酸的积累增多，进而使pH下降幅度增大，影响脱氢酶的活性，不利于菌体产氢。另外，随着底物浓度的提高，血清瓶中的氢分压也相应增大，过高的氢分压抑制氢气的生成。考虑到当底物质量浓度超过20 g/L时，目的产物氢气浓度上升而单位氢气产量却下降，故研究选取20 g/L的造纸污泥作为最适的底物质量浓度。

图4　在不同的造纸污泥浓度下发酵168 h得到的发酵产物、生物量和pH变化情况Fig.4　Effect of paper sludge concentration on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

2.5最优条件下C.thermocellum直接发酵造纸污泥产氢

基于之前的研究结果，探索最优条件下C.thermocellum直接发酵造纸污泥产生氢气的量。以20 g/L的造纸污泥为碳源，调整MTC培养基中尿素浓度和酵母提取物含量分别为15 g/L和5 g/L，以最优接种量7%(V/V)接种新鲜菌液，放置于55 ℃，150 r/min的摇床中培养，每24 h取样，连续取样至168 h，测定各瓶中氢气产量、生物量、pH值、底物降解率以及发酵液中产物的分布，其结果如图5所示。

图5　最优条件下发酵168 h得到的产物、生物量、pH和底物降解率随时间的变化曲线Fig.5　Time course of products, cell growth, pH value and substrate degradation during fermentation by C. thermocellum

C.thermocellum经过24 h的延滞期，进入对数生长期(图5(b))，在对数前期(48 h)开始有少量氢气生成(图5(a))。随着发酵的进行，氢气的产量迅速增加，呈对数增长。96 h氢气产生速率减缓，此时pH降至5.38，研究指出，产氢最适的pH的范围是5.5～7.5，在此pH范围之外时氢气产率将显著降低[17]。发酵期间，pH由最初的7.28降至最终的5.21。直至168 h发酵结束时，氢气产量达到110.61 mmol/L，与优化前相比，产量增加17.11%;底物降解率达到63.37%(图5(c))。乙酸产量的积累趋势与氢气产量相似(图5(a))。 乙醇在24 h开始产生，但浓度很低，24 h～72 h乙醇产量迅速增加，发酵结束时乙醇浓度为14.89 mM，与优化前相比，产量增加21.85%。另外，发酵结束时(168 h)，发酵液中葡萄糖含量为0.09 g/L，说明直接发酵造纸污泥后的发酵液可发酵糖含量非常低，菌体利用非常充分。

对近年来发酵(木质)纤维素原料生物制氢的研究与本研究进行了比较(表1)。造纸污泥在不进行预处理的条件下，由C.thermocellum直接发酵产氢具有显著的优势:不仅氢气产率高，而且免去了因预处理产生的成本。

发酵过程中的pH被认为是影响菌种代谢途径和产氢的最重要环境因素之一。GENG等[15]指出，添加一定浓度的KHCO3有利于延迟pH降低的时间，缓解了低pH对C.thermocellum生长和代谢的抑制，从而导致纤维素的利用率提高，产氢增加，发酵终pH维持在较高值。ZHANG等[18]也在研究中发现，氨碱法纯碱生产固体废弃物白泥中含有大量碳酸钙，在培养基中加入的白泥能参与发酵系统的酸碱平衡，增加了发酵液的碱度和缓冲能力，从而在无需外部调控pH的情况下显著提高产氢率。与此类似，造纸污泥中存在着大量的碳酸钙填料，缓冲能力较强，且富含纤维素和半纤维素，作为生物制氢的原料具有很大的潜力。

表1　木质纤维素生物制氢的比较

3结论

C.thermocellum能在不经任何预处理和不加酶的情况下直接发酵造纸污泥生产氢气，在最适接种量为7%，尿素质量浓度为15 g/L，酵母提取物的质量浓度为5 g/L，底物质量浓度为20 g/L的条件下，血清瓶培养时氢气产量达到110.61 mmol/L，相对于其他木质纤维素原料具有明显的产氢优势。

参考文献

[1]CLAASSEN P A M,DE VRIJE T,KOUKIOS E,et al.Non-thermal production of pure hydrogen from biomass: HYVOLUTION[J].Journal of Cleaner Production,2010,18(Supplement 1):S4-S8.

[2]PATEL A K,DEBROY A,SHARMA S,et al.Biohydrogen production from a novel alkalophilic isolateClostridiumsp. IODB-O3[J].Bioresource Technology,2015,175:291-297.

[3]LI Qian,GUO Chen,LIU Chun-zhao.Dynamic microwave-assisted alkali pretreatment of cornstalk to enhance hydrogen production via co-culture fermentation ofClostridiumthermocellumandClostridiumthermosaccharolyticum[J].Biomass and Bioenergy,2014,64:220-229.

[4]LIN Yun-qin,WU Shu-bin,WANG De-han.Hydrogen-methane production from pulp & paper sludge and food waste by mesophilic-thermophilic anaerobic co-digestion[J].International Journal of Hydrogen Energy,2013,38(35):15 055-15 062.

[5]江丹,李旭晖,朱明军.造纸污泥同步糖化发酵产乙醇的研究[J].食品与发酵工业,2009,35(11):32-35.

[6]王德汉,彭俊杰,戴苗.造纸污泥好氧堆肥处理技术研究[J].中国造纸学报,2003,18(1):140-145.

[7]RAGAUSKAS A, AKINOSHO H,YEE K,et al.The emergence ofClostridiumthermocellumas a high utility candidate for consolidated bioprocessing applications[J].Frontiers in Chemistry,2014,2(DOI：10.3389/978-88919-395-0).

[8]朱明军,李平,谢文化.嗜热厌氧梭菌直接发酵造纸污泥的基本特性[J].华南理工大学学报(自然科学版),2011,39(5):125-131.

[9]TANG Hong,OU Jian-fa,ZHU Ming-jun.Development of a quantitative real-time PCR assay for direct detection of growth of cellulose-degrading bacteriumClostridiumthermocellumin lignocellulosic degradation[J].Journal of Applied Microbiology,2015,118(6):1 333-1 344.

[10]ISLAM R,ÖZMIHCI S,CICEK N,et al.Enhanced cellulose fermentation and end-product synthesis byClostridiumthermocellumwith varied nutrient compositions under carbon-excess conditions[J].Biomass and Bioenergy,2013,48:213-223.

[11]LIN C Y,LAY C H.Carbon/nitrogen-ratio effect on fermentative hydrogen production by mixed microflora[J].International Journal of Hydrogen Energy,2004,29(1):41-45.

[12]BALUSU R,MOHAN R.PADURU R,SEENAYYA G,et al.Production of ethanol from cellulosic biomass byClostridiumthermocellumSS19 in submerged fermentation[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2004,117(3):133-141.

[13]ZOECKLEIN B W,FUGELSANG K C,GUMP B H,et al.Wine analysis and production[M].New York:Chapman & Hall,1995.

[14]SATO K,GOTO S,YONEMURA S,et al.Effect of yeast extract and Vitamin B12 on ethanol production from cellulose byClostridiumthermocellumI-1-B[J].Applied and Environmental Microbiology,1992,58(2):734-736.

[15]GENG A-lei,HE Yan-ling,QIAN Chang-li,et al.Effect of key factors on hydrogen production from cellulose in a co-culture ofClostridiumthermocellumandClostridiumthermopalmarium[J].Bioresource Technology,2010,101(11):4 029-4 033.

[16]ZHAO Lei,CAO Guang-li,WANG Ai-jie,et al.Simultaneous saccharification and fermentation of fungal pretreated cornstalk for hydrogen production usingThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumW16[J].Bioresource Technology,2013,145:103-107.

[17]VENKATA MOHAN S.Harnessing of biohydrogen from wastewater treatment using mixed fermentative consortia: Process evaluation towards optimization[J].International Journal of Hydrogen Energy,2009,34(17):7 460-7 474.

[18]ZHANG Ji-shi,WANG Qin-qing.Buffering and nutrient effects of white mud from ammonia-soda process on thermophilic hydrogen fermentation from food waste[J].International Journal of Hydrogen Energy,2013,38(31):13 564-13 571.

[19]CHENG Xi-yu,LIU Chun-zhao.Hydrogen production via thermophilic fermentation of cornstalk byClostridiumthermocellum[J].Energy & Fuels,2011,25(4):1 714-1 720.

[20]MOREAU A,MONTPLAISIR D,SPARLING R,et al.Hydrogen, ethanol and cellulase production from pulp and paper primary sludge by fermentation withClostridiumthermocellum[J].Biomass and Bioenergy,2015,72:256-262.

[21]SONG Zhao-xia,LI Xiao-hu,LI Wei-wei,et al.Direct bioconversion of raw corn stalk to hydrogen by a new strainClostridiumsp. FS3[J].Bioresource Technology,2014,157:91-97.

[22]CAO Guang-li,XIA Xun-feng,ZHAO Lei,et al.Development of AFEX-based consolidated bioprocessing on wheat straw for biohydrogen production using anaerobic microflora[J].International Journal of Hydrogen Energy,2013,38(35):15 653-15 659.

Study on characteristics of biohydrogen production from unpretreated paper sludge byClostridiumthermocellum

QU Xiao-su,TANG Hong,ZHU Ming-jun*

(School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

ABSTRACTPaper sludge was largely composed of cellulose and hemicellulose. It could be used as carbon source by bacteria with cellulolytic capability. Clostridium thermocellum could utilize various lignocellulose to produce hydrogen. In order to evaluate the use of cellulose contained in this type of sludge for Clostridium thermocellum to produce hydrogen, the influence of various factors including inoculum size, urea concentration, yeast extract concentration and substrate concentration on hydrogen production were studied. The maximum yield of hydrogen reached 110.61 mmol/L medium under the optimal conditions as follows: 7% of inoculum size, 15 g/L of urea, 5 g/L of yeast extract and 20 g/L of paper sludge. Paper sludge has considerable advantages over the other lignocellulosic biomass on hydrogen production, which might be attributed to the existence of calcium carbonate. This kind of alkali-rich materials could maintain the relative stability of pH thus improve hydrogen fermentation performance. The glucose concentration at the end of fermentation was lower than 0.1 g/L, indicating that no new pollutants were produced in the biodegradation.

Key wordsClostridium thermocellum(C.thermocellum); paper sludge;fermentation;hydrogen production

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606015

基金项目：国家自然科学基金(51278200 & 51478190)；广东省自然科学基金重点项目(2014A030311014)；广州市科技计划项目(201510010288)

收稿日期：2015-12-22，改回日期：2016-01-23

第一作者：硕士研究生(朱明军教授为通讯作者,E-mail：mjzhu@scut.edu.cn)。