多菌协同发酵萝卜过程中不同盐浓度对菌相的影响

黄道梅,胡露,贾秋思,郑秀艳,孟繁博,陈曦,李国林,李咏富,林茂,刘书亮*

1(贵州省现代农业发展研究所，贵州 贵阳，550006)2(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)



多菌协同发酵萝卜过程中不同盐浓度对菌相的影响

黄道梅1,2,胡露2,贾秋思2,郑秀艳1,孟繁博1,陈曦1,李国林1,李咏富1,林茂1,刘书亮2*

1(贵州省现代农业发展研究所，贵州 贵阳，550006)2(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)

摘要采用传统培养计数方法结合变性梯度凝胶电脉(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术，以自然发酵12%盐度的工业化盐渍萝卜为对照，对多菌协同发酵不同盐度(8%、10%、12%)工业化盐渍萝卜过程中(188 d)菌相变化进行了分析。结果表明：4种发酵方式盐渍水中菌落总数均维持在105～108CFU/mL左右，并呈现先上升后下降最后缓慢上升至平稳的变化趋势。乳酸菌受盐度影响较大，其数量随着盐度升高而降低，其中自然发酵盐渍萝卜比多菌协同发酵萝卜乳酸菌数低；酵母菌因其耐盐性较强受盐度影响较小，但受温度影响较大，随着温度的升高，其数量不断增加，且4种发酵方式之间酵母菌数无明显差异。4种方式盐渍萝卜中的细菌种类及真菌种类相似，优势细菌包括Weissella cibaria、Lactobacillus curvatus、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Halomonas taeanensis等，其中乳酸菌占绝大多数；优势真菌包括Kodamaea ohmeri、Debaryomyces sp.、Candida sp.等，酵母菌为主要菌群。发酵至88 d后，自然发酵中的优势细菌种类略高于多菌协同发酵；盐度的增加明显抑制了部分细菌的生长，使细菌种类及数量明显降低。自然发酵与多菌协同发酵的真菌种类在发酵过程中无明显差异，但酵母菌数量前者多于后者；不同盐浓度的酵母菌并无明显差异，发酵28 d，二次加盐使得酵母菌的种类及数量产生了差异，盐度的增加抑制了部分酵母菌的生长。

关键词盐渍萝卜；多菌协同发酵；菌相；盐度

泡菜工业作为我国蔬菜加工的一大产业，绝大多数泡菜是通过将新鲜蔬菜进行盐渍，待盐渍发酵成熟，将盐渍蔬菜进行整形、脱盐、调味、灌装、灭菌等工艺加工制成。盐渍蔬菜作为泡菜的第一道关键工序，对泡菜风味品质的形成尤为重要。由于蔬菜季节性较强，集中在冬季收获，绝大多数泡菜企业为了满足市场的大量需求，不得不加大食盐浓度(通常采用15%左右食盐浓度)来达到延长盐渍蔬菜贮藏期的目的。但泡菜生产带来的高盐废水排放问题已不能满足日益被重视的环境保护要求，限制了泡菜行业的可持续发展[1-3]。为了满足行业可持续发展要求和市场需求，低盐化人工接种发酵蔬菜将逐渐成为绝大多数泡菜企业的发展趋势[4]。

近几年来，为了满足我国泡菜行业的发展需求，国内众多研究者也开始对泡菜微生物多样性进行研究，为我国泡菜产业的长足有效发展提供了理论基础。HYUN-JU EOM等从各国泡菜发酵前期中分离出肠膜明串珠菌，证明它是启动泡菜发酵的主要菌株[5]。HARUT等采用变性梯度凝胶电脉(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术分析了韩国泡菜发酵过程中的微生物，结果表明乳酸菌为主要微生物[6]。代道芳实验表明，传统培养和PCR-DGGE方法结合能够互相取长补短，更好地获得微生物的多样性[7]。郑炯等利用PCR-DGGE方法分析了低盐和高盐腌制笋中的细菌多样性，低盐的优势菌多为益生菌，如食窦魏斯氏菌、乳球菌属、乳酸球菌属，高盐的优势菌则为抗性较强菌属[8]。本文采用工业化生产工艺，对企业规模化生产泡菜发酵过程中的菌相变化进行解析研究，为其生产过程中的质量控制和品质提升提供数据参考和技术支撑。

1材料与方法

1.1材料与仪器

圆根萝卜(RaphanussativusL.)、食盐、盐渍池：均由某泡菜企业提供。菌种：植物乳杆菌3m-1(Lactobacillusplantarum3m-1)、植物乳杆菌N2(LactobacillusplantarumN2)、肠膜明串珠菌8m-9(Leuconostocmesenteroides8m-9)、食窦魏斯氏菌SJ14(WeissellacibariaSJ14)，均由四川农业大学食品学院食品微生物实验室提供。培养基：改良MRS液体培养基[9]；系列合成培养基(MRS、孟加拉红、营养琼脂、BGLB肉汤、VRBA肉汤)，均为生化试剂(BR)。试剂：Tris碱、甲醛、硝酸银、乙二胺四乙酸二钠、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、尿素、过硫酸铵、TEMED等均为分析纯；液氮；TIANDZ柱式细菌DNAOUT，购于四川省绵阳天泽基因工程有限公司；TaqPCR Master Mix、6×Loading Buffer、Marker2000等，购于宝生物工程(大连)有限公司；引物[10](F338-GC、R518、F1427-GC、R1616)由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海三申医疗核子仪器厂；PCR仪My CyclerTMThermal Cycler，Bio-Rad；凝胶成像系统Quantity One system，Bio-Rad；Milli-Q Gradient超纯水系统Millipore；Thermo BR4i 型冷冻离心机Thermo Electron Corporation；变性梯度凝胶电泳仪美国C.B.S. Scientific。

1.2试验方法

1.2.1盐渍萝卜制作

将萝卜按某企业二次盐渍发酵工艺放入盐渍池中进行盐渍发酵，发酵7 d时，将菌株3m-1、N2、8m-9、SJ14以2∶1∶1∶1的比例添加到盐渍萝卜中，通过循环泵循环混匀，密封发酵，并设置不同盐浓度(8%、10%、12%)，以自然发酵(12%盐)为对照[11]。

1.2.2样品及其处理

用洁净塑料管沿循环管道伸入盐渍池底部采集水样，摇匀分装-20 ℃保存。取样时间点为：0、7、14、21、28、38、48、58、68、78、88、108、128、158、188 d。

1.2.3菌相变化分析

1.2.3.1传统培养计数分析无菌吸取25 mL样品于装有225 mL无菌生理盐水的三角瓶中，制成10-1稀释液后于试管内进行梯度稀释至适宜稀释度，进行以下各种微生物的分离培养与计数。菌落总数：参照GB 4789.2—2010；乳酸菌数：参照GB 4789.35—2010；酵母菌数与霉菌数：参照GB 4789.15—2010；大肠菌群计数：参照GB 4789.3—2010。

1.2.3.2PCR-DGGE技术分析参照文献[13]中略加改动：取30 mL萝卜盐渍水样品，2 000 r/min离心5 min，收集上清，8 000 r/min高速离心15 min，弃上清，收集菌体沉淀，收集的菌体用20 mL 0.1 mol/l的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)悬浮，8 000 r/min离心15 min，重复洗涤3次，洗净的菌体悬浮在3 mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，用移液器吹打后均匀，平均分装3份于2 mL EP管中，-20 ℃冻存；按照天恩泽真菌DNA提取试剂盒的使用说明结合液氮研磨方法提取微生物总DNA。将提取的总DNA溶液，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20 ℃保存备用；以提取的总DNA为模板，按表1对细菌16S rDNA V3区和真菌18S rDNA进行PCR扩增，以一次PCR产物为模板按需进行二次PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物于-20℃冰箱保存备用；对PCR扩增所得产物采用美国C.B.S. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis System进行电泳分离(电泳条件：DGGE变性胶丙烯酰胺浓度8%，变性剂溶液线性梯度40%～50%；电泳程序：60 ℃、200 V预电泳30 min，60 ℃、120 V电泳16 h/18 h)。电泳完成后，取下胶板先后进行固定、银染、显影、终止显影，然后置于凝胶成像仪拍照(图像用NTSYSpc2.1软件进行聚类分析)，将优势条带进行切割收集，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行后续的回收纯化、PCR扩增、克隆测序等步骤，最后测序结果通过 BLAST 程序与GenBank基因库中的核酸数据进行同源性比对分析，并将序列用MEGA 6软件绘制系统发育树。

表1　真菌和细菌PCR扩增程序

1.2.4数据处理

试验数据及其图表绘制采用EXCEL、Origin 8.1、SPSS 19.0、MEGA 6、NTSYSpc 2.1等软件进行处理。

2结果与分析

2.1传统培养方法检测结果分析

由图1可知，在发酵过程中，4种发酵方式的盐渍池水中的菌落总数变化趋势基本一致，发酵初期快速上升(P<0.05)，14 d时，达到最大值，四者均接近108CFU/mL。随后由于二次盐渍致使其盐度骤然升高，抑制了大量微生物的生长，致使菌落总数快速下降(P<0.05)，28 d后，随着微生物对不同盐度环境的慢慢适应，菌落总数开始逐渐增加(P<0.05)，58 d后，菌落总数开始逐渐下降(P<0.05)，可能是环境pH的降低抑制了部分微生物的生长，发酵88 d后，随着盐渍贮藏时间的继续延长，环境温度的不断升高使得其他微生物开始繁殖且自然发酵中的微生物种类丰富，菌落总数开始增加(P<0.05)。

图1　不同时期萝卜盐渍水的菌落总数变化Fig.1　Changes of total bacterial count in salt juice during fermentation

虽然不同发酵方式菌落总数的总体变化趋势基本一致，但自然发酵与多菌协同发酵之间、不同盐度发酵之间的菌落总数差异显著(P<0.05)，其中，在发酵前期，多菌协同发酵大于自然发酵，在88 d后贮藏期，自然发酵大于多菌协同发酵。提高食盐浓度可以抑制微生物的生长，低盐度盐渍池水中的菌落总数高于高盐度盐渍池水。

由图2可知，发酵初期，由于低温兼酸性环境会抑制大部分细菌的生长，乳酸菌为主要细菌菌群，乳酸菌数的变化趋势和菌落总数保持一致，发酵初期迅速上升(P<0.05)，14 d时达到最大，4者均大于108CFU/mL，随后二次盐渍致使乳酸菌数快速下降(P<0.05)，随后随着微生物对不同盐度环境的慢慢适应，乳酸菌数开始逐渐增加(P<0.05)，68 d后，乳酸菌数开始逐渐下降(P<0.05)，88 d后，乳酸菌数开始增加(P<0.05)，发酵158 d后乳酸菌数开始下降(P<0.05)。同样由结果分析可知，自然发酵与多菌协同发酵之间、不同盐度发酵之间的乳酸菌数差异显著(P<0.05)，多菌协同发酵大于自然发酵，低盐度盐渍池水中的乳酸数高于高盐度盐渍池水，且不同盐度对乳酸菌数的影响明显大于菌落总数。

图2　不同时期萝卜盐渍水的乳酸菌数变化Fig.2　Changes of lactic acid bacterial count in salt juice during fermentation

由图3可知，在发酵过程中，酵母菌数总体呈现先增加后减少的变化趋势，发酵88～188 d贮藏期，酵母菌数又呈现不断上升趋势。由于酵母菌的耐盐能力较强，因此，发酵过程中的二次盐渍对其数量影响较小，小幅度下降后随即迅速上升。由结果分析可知，酵母菌数并不同于菌落总数、乳酸菌数一样在自然发酵与多菌协同发酵之间、不同盐度发酵之间呈现一定规律性，且发酵中后期，4种发酵方式的酵母菌数均在105CFU/mL以上，这可能是因为酵母菌的好氧性，而大型的盐渍池无法严格达到厌氧环境，从而给酵母菌提供了有利生长条件。

图3　不同时期萝卜盐渍水的酵母菌数变化Fig.3　Changes of yeast count in salt juice during fermentation

由表2可知，发酵前1周，大肠菌群数较高，随着发酵的进行，酸度不断增加，从而抑制了大肠菌群的生长，发酵58 d，4种发酵方式盐渍水中的大肠菌群数均小于0.3 MPN/mL，从而也保证了成熟后盐渍萝卜的食用安全性。整个发酵过程中，4种发酵方式盐渍水中霉菌数均小于10 CFU/mL。

表2　不同时期萝卜盐渍水的大肠菌群数

2.2PCR-DGGE检测结果分析

2.2.1PCR扩增结果

采用液氮研磨结合真菌DNA提取试剂盒的方法分别对不同样品菌体沉淀进行微生物总DNA提取。以提取的总DNA为模板，采用引物F338-GC、R518和F1427-GC、R1616分别对细菌16S rDNA V3区和真菌18S rDNA进行PCR扩增，产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4、5。细菌、真菌PCR扩增产物电泳条带清晰明亮，特异性好，片段大小接近250 bp，与目标条带(约230 bp)吻合，能够达到DGGE分析要求，保证其准确可靠。

图4　细菌PCR扩增产物电泳图Fig.4　Electrophoretogram for the PCR products of bacteria

图5　真菌PCR扩增产物电泳图Fig.5　Electrophoretogram for the PCR products of fungus

由图4、图6、表3可知，不同发酵方式不同发酵时期盐渍萝卜样品中优势细菌存在差异，但由优势细菌条带测序比对结果分析可知乳酸菌为盐渍萝卜中的绝对优势菌群，整个发酵过程中，4种发酵方式盐渍萝卜的细菌丰度呈现先下降后升高的趋势，这可能与低温和盐度对细菌生长的影响有关，发酵前28 d，4个池子的细菌种类及其优势菌株无明显差异，随着二次加盐量的不同，58 d时4个池子的细菌种类及其优势菌株明显不同，盐度较低的细菌种类较为丰富，随着发酵的持续进行，由于环境温度的逐渐升高、盐渍水中的盐分逐渐向萝卜中渗透，受低温和高盐抑制的部分微生物开始大量繁殖，从而使发酵后期细菌种类增多。

当下，随着互联网5.0时代的到来，家电行业正在飞速的发展。各种款式多样、功能丰富的新产品层出不穷，导购策略也是纷繁芜杂。虽然消费者们拥有了更多家电产品的选择空间，但在无形中的选购难度也在大大增加。由此，“嘉电”评测项目应运而生。

表3　四种发酵方式盐渍萝卜发酵过程中细菌DGGE

1-12%NaCl;2-对照；3-8%NaCl;4-10%NaCl图6　不同发酵时期盐渍水中16S rDNA扩增产物的DGGE图谱Fig.6　DGGE profile of 16S rDNA amplifiled in pickled juice during fermentation

自然发酵盐渍萝卜(12%盐+未接菌)在整个发酵过程中的优势细菌主要包括Weissellacibaria、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Halomonastaeanensis等，其中Weissellacibaria虽然并未人工添加，却一直存在于整个发酵时期且基本无交替变化，这说明Weissellacibaria为盐渍萝卜中的一类优势细菌，具有较强的耐盐和耐低温能力；Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius主要出现于发酵后期，前期无明显踪迹，可能此两类菌株受温度及盐度影响较大；Lactobacillusplantarum在发酵前28 d时数量较多，随着二次加盐以及发酵的进行，数量急剧减少至消失，发酵88 d时，又开始出现，随着发酵的延长再一次增长为优势细菌；耐盐能力极强的Halomonastaeanensis在发酵前88 d一直处于优势地位，发酵至158 d时，数量开始有所减少。

1-12%NaCl;2-对照；3-8%NaCl;4-12%NaCl图7　不同发酵时期盐渍水中18S rDNA扩增产物的DGGE图谱Fig.7　DGGE profile of 18S rDNA amplifiled in pickled juice during fermentation

多菌协同发酵盐渍萝卜(12%盐+接菌、10%盐+接菌)在发酵过程中的优势细菌为Weissellacibaria、Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Pediococcusethanolidurans、Halomonastaeanensis等。其中Weissellacibaria一直存在于整个发酵时期且基本无交替变化；Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius这4类细菌受温度及盐度影响较大均活跃在发酵后期；Halomonastaeanensis变化趋势与自然发酵中一致；12%盐度中Lactobacillusplantarum变化趋势同自然发酵，而在10%盐度中一直存且基本无交替变化。多菌协同发酵盐渍萝卜(8%盐+接菌)在发酵过程中的优势细菌较多，除了上述3种盐渍萝卜中的优势细菌外，还出现了Staphylococcus、Lactobacilluspentosus、Lactobacillusacetotolerans，其中Staphylococcus在中后期数量较多，Lactobacilluspentosus基本上只存在于中期，Lactobacillusacetotolerans只在发酵88 d时出现，Weissellacibaria、Halomonastaeanensis、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusplantarum一直存在于整个发酵时期且基本无交替变化，其他优势细菌变化趋势与多菌协同发酵盐渍萝卜(10%盐+接菌)无明显差异。

综上所述，自然发酵与多菌协同发酵盐渍萝卜之间相比较，由于高盐低温环境，在发酵前中期两者中的优势细菌种类以及数量并无明显差异，发酵至88 d后，自然发酵中的优势细菌种类略高于多菌协同发酵，但自然发酵中并未检测到Leuconostocmesenteroides的存在或极少量存在。对比不同盐度多菌协同发酵盐渍萝卜之间，盐度的增加明显抑制了部分细菌的生长，使细菌种类及数量明显降低。

表4　四种发酵方式盐渍萝卜发酵过程中真菌DGGE

由图5、图7、表4可知，不同发酵方式不同发酵时期盐渍萝卜样品中优势真菌存在差异，但由优势真菌条带测序比对结果分析可知酵母菌为盐渍萝卜中的绝对优势菌群，在整个发酵过程中，4种发酵方式盐渍萝卜的真菌丰度呈现逐渐升高的趋势，与细菌的变化趋势存在差异，分析原因可能是大部分酵母菌具有较强的耐盐能力，其生长受盐度影响较小，随着环境温度的逐渐升高，其种类及数量也逐渐升高。

自然发酵盐渍萝卜(12%盐+未接菌)在整个过程中的优势真菌主要有Debaryomyceshansenii、Ambrosiozymamonospora、Saccharomycescerevisiae、Candidasp.、UnculturedDebaryomyces、Kluyveromycesmarxianus、Kodamaeaohmeri、Debaryomycessp.、Kazachstaniasiamensis、Candidalactis-condensi等，其中Saccharomycescerevisiae、Debaryomycessp.一直大量在于整个发酵过程中且基本无交替变化，说明这两类酵母菌适应力极强，受温度、盐度影响较小；Debaryomyceshansenii前期未出现，发酵至28 d时成为优势菌群，二次加盐后受高盐环境影响生长受到抑制，数量减少至消失，当发酵时间延长至158 d时，又再一次成为优势菌群；Saccharomycescerevisiae在发酵88 d时开始出现，但数量较少，发酵至158 d时繁殖成为优势菌群；Kodamaeaohmeri、Candidalactis-condensi在发酵58～88 d时出现且数量无明显差异；Kazachstaniasiamensis发酵前88 d一直存在且处于优势地位，但发酵88 d后开始减少至消失。

多菌协同发酵盐渍萝卜(12%盐+接菌)在整个发酵过程中真菌的种类及其变化趋势与自然发酵并无明显差异，但各类优势菌的条带亮度均要低于自然发酵，这说明在人工添加菌株对其酵母菌的菌群交替并无显著影响，但对抑制酵母菌生长、减少酵母菌的数量有一定的作用。

多菌协同发酵盐渍萝卜(10%盐+接菌)在整个发酵过程中的优势真菌有Debaryomyceshansenii、Candidasp.、Debaryomycessp.、Wickerhamomycesanomalus、Debaryomyceshansenii、Kodamaeaohmeri、Candidalactis-condensi等。其中，Candidasp.、Debaryomycessp.一直存在于整个发酵过程中且处于优势地位；Wickerhamomycesanomalus、Kodamaeaohmeri发酵开始并未出现，发酵中期出现，发酵88 d时消失不见，发酵158 d时再次出现；Debaryomyceshansenii仅出现于发酵28 d；Candidalactis-condensi仅出现在发酵58 d且处于优势。除上述优势菌群外，Kluyveromycesmarxianus少量存在于发酵88～158 d；Pichiamanshurica、Myxozymaudenii、UnculturedDebaryomyces在发酵末期(158 d)少量存在。

多菌协同发酵盐渍萝卜(8%盐+接菌)由于盐度较低，在整个发酵过程中的优势真菌比其他三者多，有Kodamaeaohmeri、Wickerhamomycesanomalus、Debaryomyceshansenii、Ambrosiozymamonospora、Candidasp.、Kluyveromycesmarxianus、Pichiamanshurica、Debaryomycessp.、Kazachstaniasiamensis、Candidalactis-condensi等，其中，Candidasp.、Debaryomycessp.一直存在于整个发酵过程中且处于优势地位；Wickerhamomycesanomalus发酵28 d时开始出现，后慢慢消失，发酵88 d后又出现；Debaryomyceshansenii仅在发酵28 d时出现；Kodamaeaohmeri、Ambrosiozymamonospora、Myxozymaudenii仅在发酵158 d出现；Saccharomycescerevisiae发酵88 d时出现，后慢慢消失；Kluyveromycesmarxianus在发酵88～158 d时出现；Pichiamanshurica在发酵58 d时出现，随后慢慢消失，当发酵158 d时再次出现；Kazachstaniasiamensis在发酵前88 d一直存在，末期开始逐渐消失。

综上所述，自然发酵与多菌协同发酵盐渍萝卜之间相比，在整个发酵过程中两者在真菌菌群种类上无明显差异，但多菌协同发酵盐渍萝卜由于人工添加的菌株对酵母菌的生长有一定的抑制作用，因此在酵母菌数量上前者多于后者；对比不同盐度的多菌协同发酵盐渍萝卜之间，发酵前期并无明显差异，发酵28 d二次加盐后由于不同的盐环境使得酵母菌的种类及数量产生了差异，盐度的增加在一定程度上抑制了部分酵母菌的增长。

3结论与讨论

乳酸菌、酵母菌是蔬菜发酵过程中的优势菌群，乳酸菌产酸使其乳酸含量不断积累，从而抑制腐败微生物的生长，部分酵母菌不断产生乙醇、酯类等风味物质，赋予独特的风味，另部分酵母菌会导致泡菜产膜生花，引起腐败，研究表明，毕赤酵母属(Pichiasp.)、假丝酵母属(Candidasp.)在酸性条件下易产膜，是导致泡菜在贮藏过程中生花的主要菌群[13-14]。

微生物的生长很大程度上受环境因素影响，同一环境中不同微生物生长和不同环境中同种微生物生长均存在差异[15]。本文中，盐度、温度是影响微生物生长的主要因素。在整个发酵过程中，4种发酵方式盐渍水中菌落总数均维持在105～108CFU/mL左右，呈现先上升后下降最后缓慢上升至平稳的变化趋势；乳酸菌受盐度影响较大，盐度高的盐渍萝卜比盐度低的乳酸菌数低，自然发酵盐渍萝卜比多菌协同发酵乳酸菌数低，这也是自然发酵、高盐度发酵滞后的主要原因之一；酵母菌因其耐盐性较强受影响较小，但受温度影响较大，随着温度的升高，酵母菌数不断增加；发酵58 d后，均未检测到霉菌和大肠菌群的存在，从而保证了成熟盐渍萝卜的使用安全性。在发酵过程中，提高食盐浓度虽然能够抑制部分杂菌的生长，但同时抑制了乳酸菌的发展，延长了发酵时间，因此选择适宜的盐浓度是关键。

通过PCR-DGGE对发酵过程中的菌群变化分析，工业化盐渍萝卜发酵过程中优势细菌包括Weissellacibaria、Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Pediococcusethanolidurans、Halomonastaeanensis等，其中乳酸菌占绝大多数，优势真菌包括Kodamaeaohmeri、Debaryomycessp.、Candidasp.、Kazachstaniasiamensis等，酵母菌为主要菌群，这与众多学者研究结果相似[13-18]。

在整个发酵过程中，Weissellacibaria始终作为优势细菌大量存在，也成为自然发酵的主要菌群，说明Weissellacibaria本身就是盐渍萝卜发酵过程中的主要发酵菌株，LEE等[19]通过DGGE对不同发酵时期朝鲜泡菜检测，发现Weissellaconfuse、Lactobacillussakes、Lactobacilluscurvatus等为微生物群落的主要组成成员, 赵永威等[20]揭示了魏斯氏菌属为冬瓜腌制过程中的优势种群之一。而肠膜明串珠菌作为添加菌种之一，大量存在于多菌协同发酵盐渍萝卜的后期过程中，自然发酵中仅少量存在，推测肠膜明串珠菌的添加对改善风味有一定功效，有别于PEDERSON等[21]、EON等[6]由肠膜明串珠菌启动发酵的研究结果，可能是肠膜明串珠菌受盐度影响较大所致。植物乳杆菌作为另一添加菌株广泛存在于整个发酵过程中，但在58 d时因受高盐抑制少量存在于12%盐度的盐渍水中。

Candidasp.、Debaryomycessp.这两类酵母菌大量存在于整个发酵过程中，研究表明Candidasp.在酸性条件下易产膜，因此发酵中后期池面产生大量膜状物，可能与Candidasp.的生长密切相关。Kazachstaniasiamensish大量存在于发酵前88 d，随着发酵的完成，开始慢慢减少至消失。在多菌协同发酵和自然发酵过程中，Kodamaeaohmeri、Ambrosiozymamonospora、Pichiasp.、Kluyveromycesmarxianus等菌不断交替变化产生的差异，导致最后泡菜风味品质的差异性。

本文采用工业化生产工艺，人工强化接种技术，并首次人工添加食窦魏斯氏菌属，对不同盐浓度泡菜多菌协同发酵过程中菌相变化进行解析研究。人工添加的菌株在发酵过程中起到了强化发酵的作用，其中食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)对不同盐浓度均有较强的耐受能力，可以作为优良发酵菌株广泛应用于发酵蔬菜生产中。另外，盐浓度的增加对盐渍萝卜发酵过程中微生物的种类及数量都有一定的抑制作用，尤其是细菌，应适当降低盐浓度有助于发酵过程中微生物的生长，泡菜特殊风味的形成。该研究结果为泡菜的工业化生产中人工接种技术的应用及产膜生花的防治提供了数据参考。

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Effect of different salinity on the microbial community diversity during strains synergism fermentation of pickled radish

HUANG Dao-mei1,2, HU Lu2, JIA Qiu-si2, ZHENG Xiu-yan1, MENG Fan-bo1,CHEN Xi1，LI Guo-lin1, LI Yong-fu1, LI Mao1*, LIU Shu-liang2*

1 (Guizhou Institute of Modern Agricultural Development, Guiyang 550006,China)2 (College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014,China)

ABSTRACTThe traditional cultivate counting method combined with PCR-DGGE technique was adopted in this paper. Industrialized pickled radish with salinity of 12% from natural fermentation was used as control. The microbial community diversity in different salinity radishes from strains synergism fermentation was analyzed. The results showed that strains quantity was maintained at 105～108 CFU/mL in the pickled water from four ways fermentation, and had a trend of increasing in the beginning and then went down and ascended steadily at last. Salinity had great influence on lactic acid bacteria. The lactic acid bacteria count of pickled radishes with high salinity were less than that of pickled radishes with low salinity, and that of pickled radishes from natural fermentation were less than that of pickled radishes from strains synergism fermentation. Yeast had a high ability of salt tolerance, but it was more vulnerable to temperature. By temperature increasing, yeast count was increased continuously. There was no significant difference in four ways fermentation. Using these four modes, bacteria and fungi species in pickled radishes were similar. The main advantage strains included Weissella cibaria, Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Halomonas taeanensis etc., most of them were lactic acid bacteria. The advantage fungi included Kodamaea ohmeri, Debaryomyces sp., Candida sp. etc., wherein yeast were the main microbial community. After 88 days, though the bacteria species during natural fermentation were slightly more compared with strains synergism fermentation, the increase of salinity obviously restrained part of bacterial growing. In fungal species, there was no significant difference between natural fermentation and strains synergism fermentation, but during the whole fermentation, the former fungal count was higher. There was no obvious difference among different salinity pickled radish from strains synergism fermentation during early stage fermentation, however, secondary addition of salinity led to variations of fungal species and its count after 28 days of fermentation. The increase of salinity inhibited the growth of some yeast.

Key wordspickled radish; strains synergism fermention; the microbial community diversity; salinity

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606007

基金项目：黔科合院所创能([2012]4002)；黔科合条(X[2014]4001)；黔科合条(NY[2013]3051)；四川省农业科技成果转化资金项目(14NZ0012)

收稿日期：2015-12-24，改回日期：2016-02-25

第一作者：硕士研究生(刘书亮教授为通讯作者,E-mail：lsliang999@163.com)。