大黄提取液促进大鼠结肠肥大细胞和嗜酸性粒细胞增多反应

吴　迪　徐敬东　朱进霞

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069)



大黄提取液促进大鼠结肠肥大细胞和嗜酸性粒细胞增多反应

吴迪徐敬东*朱进霞*

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069)

【摘要】目的 大黄具有清热解毒和润肠通便的作用。本实验结果显示短期服用大黄后，肥大细胞和嗜酸性粒细胞在大鼠的结肠有大量聚集。本研究意在探讨大黄提取液促进大鼠结肠肥大细胞和嗜酸性粒细胞增多反应的作用。方法使用免疫组织化学、免疫荧光及酶联免疫吸附的方法探讨不同剂量大黄灌胃后，大鼠结肠部位肥大细胞、嗜酸性粒细胞和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)及白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的变化。结果大黄可激活肥大细胞、并可使嗜酸性粒细胞出现明显聚集，同时引起IFN-γ增加和IL-10降低的免疫保护机制。结论短期服用大黄可以引起结肠部位肥大细胞和嗜酸性粒细胞聚集，该作用对大黄的润肠通便作用具有重要意义。

【关键词】大黄；肥大细胞；嗜酸性粒细胞；过敏反应

大黄为蓼科大黄属植物，大黄的干燥根和块茎作为传统中药大黄(RheumpalmatumL.)被广泛使用。药典中所使用的药品大黄为药用大黄(RheumoffcinaleBaill.)、唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim.exBalf.)和掌叶大黄(RheumpalmatumL.)。大黄的主要成分为蒽醌类化合物，有研究显示，大黄具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、抗糖尿病[4]、消炎[5]等作用。大黄主要发挥作用的成分——大黄素能减少炎性反应细胞因子和炎性介质的释放，发挥抗炎作用[6]。肥大细胞激活后可释放多种细胞因子并趋化嗜酸性粒细胞聚集[7]。短期使用大黄，会引起明显的腹泻，但是腹泻作用又可以呈现一种负反馈的调节特性，该作用的可能机制未见报道。本文探讨短期使用大黄所引起腹泻以及负反馈的可能机制。

1材料与方法

1.1材料

唐古特大黄干燥根及块茎饮片采购于北京同仁堂，由首都医科大学宣武医院王文教授进行物种鉴定。肥大细胞类糜蛋白酶抗体(美国Abcam公司，货号：Ab2377);大鼠酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(北京瑞格博科技发展有限公司);莱卡冰冻切片机(德国Leica，型号：CM1850);莱卡共聚焦显微镜(德国Leica，型号：TCSSP5);莱卡生物显微镜(德国Leica，型号：DM5000)。

1.2实验方法

1.2.1大黄提取液的制备

将大黄干燥根及块茎饮片于蒸馏水中浸泡30 min后，中高火煮沸2 h，定容至1 mg/mL，保存至4 ℃冰箱。

1.2.2实验动物的给药方法

雄性SD大鼠24只，体质量220～250 g，由首都医科大学实验动物部提供，经实验动物福利委员会许可，实验动物许可证号:SCXK(京)2012-0001，动物在室温条件饲养，正常更替光照，24 h 食水供应。采用数字表法将其随机分为实验组和对照组， A 组：正常对照组；B 组:实验3 g/kg剂量组；C 组:实验6 g/kg剂量组。实验组根据剂量安排给大鼠服用大黄提取液。正常对照组给予6 g/kg的蒸馏水。

1.2.3取材

以4 mL/kg的剂量给予大鼠10%(质量分数)水合氯醛麻醉，开腹腔后从腹主动脉取血，静置12 h，离心8 000 r/min，取上层清液即血浆，使用ELISA法测定结果。取大鼠结肠于4%(质量分数)多聚甲醛中固定24 h，依次用含有15%(质量分数)、30%(质量分数)蔗糖的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)脱水24 h。使用OCT包埋剂包埋后，进行7 μm的连续切片。

1.2.4免疫荧光

大鼠结肠切片在室温中风干24 h后，浸泡在柠檬酸钠中，用微波炉加热保持在95 ℃～100 ℃，进行抗原修复15 min，使用PBS连续洗涤3次，每次5 min，使用PBST(PBS +2‰Tween-20)配制而成的5%(体积分数)驴血清进行封闭30 min，孵育一抗过夜，再使用PBST洗涤后孵育二抗2 h，使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)进行细胞核的染色，使用甘油封片。

使用共聚焦显微镜在放大20倍的物镜下在每张切片上拍摄8张照片，使用Image-Pro Plus 6.0图像统计软件统计特定阳性荧光相对表达量，取8张照片的荧光相对表达量的平均值。

1.2.5HE染色

嗜酸性粒细胞可在HE染色后显示为红色。对每只大鼠结肠随机切取3张切片，使用显微镜在放大40倍的物镜下在每张切片随机观察10个视野内嗜酸性粒细胞的数量，取30张计数值的平均值。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0统计软件处理。所有数据均使用均数±标准误(mean±SE)表示。各指标比较均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)中的Turkey方法，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2结果

2.1大黄促进大鼠腹泻的作用

与正常组大鼠相比，用3 g/kg、6 g/kg大黄灌胃后，大鼠粪便内水的量随大黄增加而增加，服用大黄后，粪便更易排出，结果详见图1。

2.2大黄对大鼠结肠肥大细胞的影响

在给大鼠灌胃不同剂量大黄12 h后，取远端结肠，使用肥大细胞标记物类糜蛋白酶用免疫荧光定位技术，观察到有肥大细胞聚集现象。正常大鼠结肠部位肥大细胞每个视野荧光相对表达量为(22.33±8.02)，3 g/kg剂量组为(35.40±5.84)增加近58.53%(P<0.05,n=8)，6 g/kg剂量组则为(139.70±34.38)，大鼠肥大细胞增加近426.3%(P<0.01,n=8)，结果详见图2。结果提示大黄具有刺激结肠黏膜下肥大细胞增多和聚集的效应。

图1　肠道内粪便形状的对比

图2　肥大细胞在结肠部位的分布

2.3大黄对大鼠结肠嗜酸性粒细胞数量的影响

使用HE染色对比正常大鼠结肠部位的嗜酸性粒细胞数量，在3 g/kg组出现嗜酸性粒细胞显著聚集现象，平均每个视野下从正常组(3.12±2.48)个增长至(9.32±3.63)个(P<0.01,n=8)，而6 g/kg组较3 g/kg组，嗜酸性粒细胞聚集现象更加明显，达到平均每个视野(14.06±2.21)个(P<0.001,n=8)，结果详见图3。

图3　大鼠结肠内嗜酸性粒细胞分布

A:control group; B: Rhubarb group at the concentration of 3 g/kg; C: Rhubarb group at the concentration of 6 g/kg; D: bar as a statistical results; Scale bar：40 μm;***P<0.001vscontrol group;n=8.

2.4大黄对IFN-γ 及IL-10的影响

使用ELISA法测定血清中干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)及白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的变化，如图4A结果显示，正常组大鼠血液中IFN-γ为(183.82±13.40)ng/L，3 g/kg组为(193.63±4.11)ng/L，增加约5.44%(P>0.05，n=8)，但差异无统计学意义；6 g/kg组为(226.04±16.80)ng/L，与正常组相比，IFN-γ明显增加约22.96%(P<0.05，n=8)。结果详见图4B，3 g/kg和6 g/kg大黄组大鼠血液中的IL-10均有显著下降，分别为(112.52±6.40)pg/mL和(109.91±4.188)pg/mL，与正常组大鼠血液中浓度(136.60±10.88)pg/mL相比，分别下降17.62%(P<0.05，n=8)和19.53%(P<0.01，n=8)。结果提示短期使用大黄提取液后具有升高IFN-γ而降低IL-10的作用。

图4　大鼠血液中IFN-γ及IL-10的测定

A: content of IFN-γ in blood of rat in the different groups; B: content of IL-10 in blood of rat in the different groups;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group; IFN-γ:interferon-γ; IL-10: interleukin-10；n=8.

3讨论

当嗜碱性粒细胞从血管游离至结缔组织和黏膜上皮内时，称为肥大细胞，其结构和功能与嗜碱性粒细胞十分相似，和嗜酸性粒细胞在过敏反应中共同发挥主要作用[7]。在过敏反应中，肥大细胞会迅速聚集并脱颗粒，释放组胺、白三烯、趋化因子和多种炎性反应因子，引发机体消化道、呼吸道、皮肤等部位局部的超敏反应，严重的会引起全身性的过敏反应[8]。肥大细胞被激活时，释放出趋化因子，使嗜酸性粒细胞聚集到同一局部[8-9]，并限制肥大细胞或嗜碱性粒细胞的活性。嗜酸性粒细胞作为白细胞的一种，在炎性反应、过敏反应、免疫调节、免疫防御中发挥作用[10]。嗜酸性粒细胞可产生前列腺素E使嗜碱性粒细胞合成释放生物活性物质的过程受到抑制；同时可以吞噬嗜碱性粒细胞所排出的颗粒，使其中含有生物活性物质不能发挥作用；另外可以释放组胺酶等酶类，抑制肥大细胞所释放的组胺等活性物质，对由肥大细胞引起的反应起到一定的抑制作用作用[11]。

本实验中用中药大黄提取液灌胃大鼠12 h后，出现大鼠粪便中水的量增加，排便数量增加的现象，且在结肠黏膜下层出现肥大细胞和嗜酸性粒细胞明显增加的现象，提示在药物使用初期可能激活了机体的免疫保护机制，使得药物引起的腹泻得到抑制或缓解。

肥大细胞还可以通过产生IL-10介导免疫抑制效应，它可以抑制 TH1 细胞合成IL-2、IFN-γ[12]；并通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原Ⅱ(classⅡmajor histocompatibility complex, MHCⅡ)的表达,降低其抗原呈递的作用；降低T淋巴细胞活性，抑制炎性细胞的激活、迁移与黏附和炎性反应因子的合成与释放，而且IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-n,TNF-α)、巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)的合成都受到内源性与外源性IL-10在转录水平的负调节，抑制炎性反应发生，达到抗炎的效果[13]。而在本实验中笔者观察到，对正常大鼠使用大黄后，IL-10没有升高，反而出现下降趋势，这说明短期使用大黄引起的肥大细胞聚集引起炎性反应的同时抑制炎性反应的过程，这提示可能启动了自身的免疫保护作用。

大黄能减少炎性反应细胞因子和炎性反应介质的释放, 起到抗炎作用作用[14]。但对正常大鼠短期使用大黄会出现炎性反应现象，并且出现腹泻及结肠轻微水肿和充血现象，这与肠道过敏反应表现相一致，提示在使用大黄提取液的早期肥大细胞使局部组织胺增加，引起了肠道的局部免疫反应，引起肠道的运动和分泌功能的增强；同时嗜酸性粒细胞的增多又抑制了肥大细胞引起了肠道的局部免疫反应。该研究结果可以解释大黄既可以引起的腹泻，同时又可以对腹泻起到负反馈调节作用。

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编辑孙超渊

Rhubarb extract solution enhances mast cells and eosinophils in rat colon

Wu Di, Xu Jingdong*, Zhu Jinxia*

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

【Abstract】ObjectiveSince its effect of detoxification and laxative, it was found that mast cells and eosinophils have a large concentration on the rat colon after a short-term administration of Rhubarb in our investigation. This phenomenon of allergy caused by Rhubarb has not been reported. The aim of the study is to investigate the function that Rhubarb extract solution should be able to aggrandize mast cells and eosinophils on rat colon. MethodsIn order to explore the changes of mast cells, eosinophils, interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-10 (IL-10) on the effect of different doses of Rhubarb, we gave the rats Rhubarb extract solution by intragastric administration. The samples were measured by means of immunohistochemistry, immunofluorescence and ELISA. ResultsRhubarb could make mast cells activated and eosinophils accumulated significantly, causing an increase of IFN-γ and a decrease of IL-10, as while other phenomenon of allergy.ConclusionAdministration of Rhubarb for 12 h can cause mast cell and eosinophil enhanced and accumulated in rat colon. It is vague how and why Rhubarb enhances the mast cell and eosinophil, which needs further research.

【Key words】Rhubarb；mast cell；eosinophil；allergy

基金项目：国家自然科学基金(81274173),北京市自然科学基金(7122017)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81274173)， Natural Science Foundation of Beijing (7122017).

*Corresponding authors， E-mail：xujingdong@163.com； zhu_jx@ccmu.edu.cn

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.019]

【中图分类号】R 285

(收稿日期：2016-03-01)

网络出版时间：2016-06-0719∶00网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1900.028.html

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