蒙古马皮肤肥大细胞两种染色方法的比较＊

赵一萍，庄 玉，芒 来＊，白东义，赵启南

（1.内蒙古农业大学动物科学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018）

肥大细胞（mast cell，MC）定居在机体各个组织中，如皮肤、淋巴样组织、子宫、膀胱、肠系膜、消化道的浆膜和黏膜下层、血管周围以及肺组织。肥大细胞在与外界环境接触的部位（皮肤，气管和肠道等）中起着"第一道防线"的作用，在结缔组织中扮演"微脉管系统信息传递者"作用［1］。肥大细胞被激活后，能迅速地、选择性地产生恰当的介质引发保护性先天免疫反应和生理反应［2］，并通过介质导致快速的炎症反应，接着招募细胞因子和增加肥大细胞数目。国内外对于不同物种、不同组织肥大细胞的研究非常广泛［3－5］，但对于马的研究相对较少，特别是国内仍未见相关报道。本文就蒙古马皮肤中肥大细胞的形态、分布进行分析，为进一步研究蒙古马不同组织器官肥大细胞的分布、数量以及肥大细胞内所含物质奠定基础，进而为深入探讨肥大细胞在蒙古马免疫功能上的作用提供组织形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 在内蒙古自治区包头市达茂旗、锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗牧区随机选取9匹蒙古马。

1.1.2 试剂与仪器 甲苯胺蓝，藏红O，其他试剂均为分析纯；光学显微镜，轮转式切片机等。

1.2 方法

1.2.1 切片标本制备 马匹局部麻醉进行活体皮肤采样，固定在Carnoy氏液中，固定1个月，常规脱水、透明、石蜡包埋、制备5μm切片备用。

1.2.2 甲苯胺蓝－藏红 O染色法（RTB－S） 甲苯胺蓝染液（toluidine blue）：0.5mol／L 盐酸溶液配制pH 0.5的5g／L甲苯胺蓝溶液。藏红O复染液（safranin O）：0.125mol／L盐酸配制的2.5mL／L的藏红O染液。切片常规脱蜡至0.5mol／L盐酸溶液漂洗5min，入常规甲苯胺蓝染液中浸染30min，再入0.5mol／L的盐酸溶液冲洗30s，藏红O复染30s，快速脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察、采集图像。

1.2.3 改良甲苯胺蓝－藏红 O 染色法（MTB－S）切片常规脱蜡至蒸馏水，入改良甲苯胺蓝染液30s，蒸馏水迅速洗2次，950mL／L酒精分色（一般为5s）在镜下控制。藏红O复染5s（或30s），快速脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察、采集图像。

2 结果

从染色标本可见蒙古马皮肤内存在大量的肥大细胞。在低倍镜下观察，肥大细胞主要分布于真皮结缔组织和皮下组织中，多见于毛囊（图1）、血管（图2）、皮脂腺和汗腺（图3）附近。肥大细胞大小不等，成簇分布或单一分布，呈近圆形、椭圆形、长梭形或不规则形态。高倍镜下观察（图4），胞浆充满蓝紫色的圆形颗粒，胞质中充满大量的异染颗粒，颗粒密度与色深浅不一致。在相同倍镜下观察（图1～3），改良甲苯胺蓝－藏红O染色法（图2和图3）比甲苯胺蓝－藏红O复染法（图1）能够更好的显示肥大细胞，并且改良甲苯胺蓝－藏红O染色法复染5s（图2）的效果优于复染30s的效果（图3）。

图1 蒙古马皮肤 MC，RTB－S染色（100×）Fig.1 Skin mast cells of Mongolia horse，RTB－S staining（100×）

图3 蒙古马皮肤MC，MTB－S染色（复染30s）（100×）Fig.3 Skin mast cells of Mongolia horse，MTB－S staining（30scounterstaining）（100×）

3 讨论

3.1 固定液与染色方法

范春玲等［6－7］等研究证明，Carnoy氏液是一种良好的显示肥大细胞的固定液。因此，本试验采用Carnoy氏液作为固定液。本研究发现，利用改良甲苯胺蓝－藏红O染色法比甲苯胺蓝－藏红O复染法能够更好的显示肥大细胞（图1～图3），这可能是因为甲苯胺蓝被煮沸10min后再逐滴滴入高锰酸钾，得到了充分氧化的结果；其中改良甲苯胺蓝－藏红O染色法复染5s的效果优于复染30s的效果（图2与图3），图3中大部分肥大细胞被藏红O染成红色，而图2中肥大细胞仍呈蓝紫色，清晰可见。

3.2 马肥大细胞的研究

对于马肥大细胞结构形态描述，最早见于Mair T S等［8］报道，证明在马呼吸黏膜和肺中肥大细胞的显微和超微结构特征与其他物种描述相似，并且肥大细胞内颗粒包含两种类型与人肥大细胞相似。在本研究中也得到了蒙古马皮肤肥大细胞的显微结构与很多其他物种描述的类似，如兔［9］，鼠［10］等。Winder N C等［7］证明，对于鉴别肥大细胞，组织固定在Carnoy氏液中优于固定在福尔马林中，并通过分析正常和病理马肺样本肥大细胞的切片，发现与正常样本相比，肥大细胞在轻度和中度慢性支气管炎样本上有少量增加，在轻度、中度和重度毛细支气管炎和肺胸膜纤维化中，小的和大的支气管周围也观察到肥大细胞的增加，纤维化的肺泡隔膜上肥大细胞的增加最显著，大约是正常组织的4倍。

图2 蒙古马皮肤 MC，MTB－S染色（复染5s）（100×）Fig.2 Skin mast cells of Mongolia horse，MTB－S staining（5scounterstaining）（100×）

图4 蒙古马皮肤 MC，MTB－S染色（复染5s）（400×）Fig.4 Skin mast cells of Mongolia horse，MTB－S staining（5scounterstaining）（400×）

马肥大细胞的研究与其他物种肥大细胞的研究一样，也主要集中在过敏性疾病中。肥大细胞表面的特异性受体FcεRI和IgE结合后，过敏原通过和肥大细胞上IgE结合而激活肥大细胞，使其脱颗粒释放血管活性物质、炎症介质等［11］。Langner K F等［12］证明，在诊断马匹夏季湿疹，利用效应细胞（肥大细胞，嗜碱粒细胞）检测过敏症比通过ELISA血清学分析要精确，为临床上检测过敏反应应用提供了依据。Wagner B等［13］研究表明，在马不同年龄阶段，IgE都是肥大细胞和嗜碱颗粒致敏反应的主要免疫球蛋白；在年龄小的马上，IgG（T）抗体不能在肥大细胞和嗜碱颗粒的致敏反应中起重要的作用，其在成年马上的作用机理也不清楚。对于肥大细胞相关基因正在进行研究［14］，这将更深层次挖掘肥大细胞的作用机理。

马肥大细胞在机体防御反应及先天免疫中的作用研究报道比较少，这将成为马肥大细胞研究的新的方向，从而为马抗病、抗逆性的研究提供新的思路。本研究虽然只是对蒙古马皮肤肥大细胞不同染色方法的进行了比较研究，但这为蒙古马肥大细胞介质的释放、凋亡及其功能等研究奠定了基础。

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