特异性PCR方法快速诊断假性皮疽组织胞浆菌

杨聚奇 赵兴绪/甘肃农业大学



特异性PCR方法快速诊断假性皮疽组织胞浆菌

杨聚奇 赵兴绪/甘肃农业大学

马流行性淋巴管炎（epizootic lymphangitis，EL）是由伪皮疽组织胞浆菌（Histoplasma farciminosum）引起多种动物以形成淋巴管和淋巴结周围炎、肿胀、化脓、溃疡和肉芽肿结节为特征的慢性传染病。2014年8月18日，靖远县高湾乡农户家出现马、骡、驴等马属动物发病情况，发病动物初期出现跛行，四肢、颈部等皮肤出现豌豆大或核桃大的硬性结肿，后破溃流出黄白色或淡红色脓液，逐渐形成溃疡，继后肉芽增生，溃疡高于皮肤表面如蘑菇状或周围突起中间凹陷，易于出血，不易愈合。部分马属动物鼻黏膜有大小不同的黄色圆形或椭圆扁平隆起或鼻腔流出少量脓性鼻漏，眼睑结膜部有溃疡性结膜炎。8月20日～23日接到部分户主电话，为了找出引起暴发的可能病因及风险因素，8月25日开始介入调查，10月27日结束，期间共到高湾乡7次收集信息，并采集典型病例的患病部位病料进行实验室诊断。

一、假性皮疽组织胞浆菌H212分离株内含肽Prp8前体基因PCR检测与鉴定

（一）相关试剂

DL2000 DNA Marker，Agarose Gel DNA Extraction Kit 均购自OMEGA公司，DNA提取试剂盒为Roche罗氏，TaKaRa PCR Amplification Kit 购于大连宝生物。

（二）引物设计与合成

根据参考基因序列（GenBank： JX274629.1），利用 Primer Premier 5.0 设计并合成了用于鉴定假性皮疽组织胞浆菌中（Histoplasma capsulatum var. farciminosum isolate H212 intein-containing Prp8 precursor）基因的特异性引物，引物序列由大连宝生物合成。

上游-F： 5'TCGCATTAG-TATTGACGCTGAC 3'

下游-R：5'AGAGCTG-GTCTTTATCGACTCTG 3'

（三）假性皮疽组织胞浆菌基因组的提取

1.取收集的病料置37℃/-20℃的条件下反复冻溶3次，吸取上清液200μl，加入200 ul trizol，剧烈振荡30 s，12 000 rpm离心2 min；

2.取上清200 ul，加入100 ul的苯酚和100 ul的氯仿，剧烈振荡30 s，12 000 rpm 离心2 min；

3.取上清150 ul，加入300 ul无水乙醇，上下巅倒几次，12 000 rpm离心2 min；

4.弃上清，加入1 000 ul 75%的乙醇，12 000 rpm离心2 min；

5.弃上清，于56℃烘箱中烘干；

6.加入30～50 ul超纯水，95℃～100℃加热5 min。直接进行PCR或于-20℃冰箱保存备用。

（四）病料中假性皮疽组织胞浆菌内含肽Prp8前体基因的检测

在病料中对假性皮疽组织胞浆菌基因组进行提取后，用TaKaRa PCR Amplification Kit对提取的病料基因进行用PCR检测。

PCR扩增基因的反应条件分别为：94℃ 5 min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 2 min，共35个循环，72℃10 min，4℃结束反应。将扩增的PCR产物，送大连宝生物公司进行测序。

（五）琼脂糖凝胶电泳

配制1.0%的琼脂糖凝胶，按终浓度1 ug/ml加入E.B.，取5 ul PCR产物与0.5 ul 10倍加样缓冲液混合均匀，以DL2000 Marker作对照，85V恒定电压电泳30 min后，在紫外透射仪下观察，并记录结果。

图4 目的基因PCR扩增

二、DNA测序

将核酸电泳检测为阳性PCR产物送上海生工生物工程技术公司进行测序。

得到的测序结果用DNAStar软件（5.0版）进行分析，并在基因库中进行序列比对分析。以此确定特异PCR作为诊断方法的准确性。

（一）测序结果分析

基因测序后比对的结果可查询网址（http：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），与H212菌株的同源性为99%，与其他假性皮疽组织胞浆菌菌株同源性也在98%以上。

（二）特异性PCR扩增

疽杆菌、链球菌、假性皮疽组织胞浆菌的基因进行扩增检测，根据PCR最佳条件扩增条件，用特异性引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，结果显示这对特异性引物只能扩增出假性皮疽组织胞浆intein-containing Prp8 precursor基因。

三、讨论

（一）特异性引物的设计问题

建立PCR诊断方法，引物的设计至关重要。该试验在设计引物时，所选用的模板序列是假性皮疽组织胞浆intein-containing Prp8 precursor基因。这个基因在基因库中与其他病原的基因同源性在80%以下，只有和荚膜阿耶罗菌nam1 mRNA前体的加工剪接因子8这个部分基因有98%的同源性，但是荚膜阿耶罗菌nam1 mRNA前体的加工剪接因子8这个基因是mRNA，首先需要反转录合成cDNA，而假性皮疽组织胞浆inteincontaining Prp8 precursor基因是DNA，在试验过程中直扩增的是DNA，所以荚膜阿耶罗菌nam1 mRNA前体的加工剪接因子8基因不会影响本实验特异性试验。基因测序后比对的结果可查询网址（http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi），与H212菌株的同源性为99%，与其他假性皮疽组织胞浆菌菌株同源性也在98%以上。

（二）PCR实验条件的优化

由于存在污染、聚合酶抑制剂、不适宜的反应条件影响反应灵敏度，导致假阴性或假阳性结果等原因，因此利用PCR方法建立的诊断体系，必须在应用于临床常规检查前，对影响PCR反应的各个因素进行优化，筛选出最佳反应体系，从而达到提升PCR诊断方法敏感性和特异性的目的。影响PCR方法敏感性的因素非常多，但据文献报道，Mg2+浓度和退火温度是影响PCR结果的主要因素，直接影响到PCR能否成功。在不同的引物一模板系统中，最适合的Mg2+也不相同；而退火温度升高，可以防止非特异性扩增现象所以本次实验主要从Mg2+，浓度和退火温度来优化反应条件，确定特异引物所能扩增理想模板量的最佳反应条件，这对简化操作程序具有重要意义。

（三）病原样品的选择

本试验选择疽杆菌、链球菌、假性皮疽组织胞浆菌作为特异性试验的样品。由于这三种在文献报道中引起的临床症状最为相似。除此之外，通过基因库中对比查询，未在发现同源性高的其他病原。因此本诊断方法选择它们作为特异性试验的样品。

（四）结论

综上所述用特异PCR方法来快速诊断假性皮疽组织胞浆菌是可行的，本方法克服了传统方法的一些弱点，具有特异性强，敏感性高，稳定性强，简便，快速的优点，对于假性皮疽组织胞浆菌病分子流行病学的调查、诊断、疾病的防制都具有重要的意义。

参考文献（略）