猪血清对猪肺炎支原体培养影响的研究
2016-07-14郑铁鑫张影柴华尹尧付丽杰哈药集团生物疫苗有限公司
郑铁鑫 张影 柴华 尹尧 付丽杰/哈药集团生物疫苗有限公司
猪血清对猪肺炎支原体培养影响的研究
郑铁鑫 张影 柴华 尹尧 付丽杰/哈药集团生物疫苗有限公司
一、材料
(一)菌株
1.猪肺炎支原体P-5722-3株,由美国硕腾动物保健公司提供,哈药集团生物疫苗有限公司保藏。
2.猪肺炎支原体P-5722-3株CCU阳性标准品(CCU检测),由美国硕腾动物保健公司提供,哈药集团生物疫苗有限公司保藏。
(二)完全培养基
1.培养基组分A:根据猪肺炎支原体P-5722-3株培养基配方要求,制备组分A。
2.培养基组分B:猪血清
3.猪肺炎支原体P-5722-3株完全培养基由培养基组分A与培养基组分B共同制备,培养基组分A由哈药集团生物疫苗有限公司采用无菌过滤方式制备,培养基组分B采用热灭活方式制备。
(三)无菌检验培养基
酪胨琼脂斜面(G.A)、硫乙醇酸盐酪胨汤(T.G)葡萄糖蛋白胨(G.P),均由本公司培养基班组提供。
(四)设备
恒温振荡器:上海世平实验设备有限公司SPH-211C
PH计: METTER TOLEDO FE 20C
二、方法
(一)试验方法
针对培养组分B,分别选择5种猪血清,进口猪血清1#(美国产)、进口猪血清2#(新西兰产)、国产猪血清3#、国产猪血清4#、国产猪血清5#,各2个批次,按培养基总量10%与培养基组分A制备成猪肺炎支原体完全培养基,进行平行培养试验,猪血清在使用前均采用56℃,30 min热灭活处理。
(二)培养方法
取猪肺炎支原体P-5722-3株菌株按10%接种完全培养基中,37℃振荡培养,每隔8 h检测一次PH值,当PH值接近6.8时,将检测时间缩短,直至PH值到达6.8左右时,取少量样品进行检测并传代培养,连续传代培养三代并分别进行无菌检验。
(三)菌液浓度测定方法
采用CCU法(颜色变化单位测定法),该方法是以微生物在培养基中的代谢活力为指标,来计算微生物的相对含量,取51支无菌培养管,每一管装1.8 ml猪肺炎支原体完全培养基(含有酚红);在第一管加入0.2 ml待测猪肺炎支原体菌液,充分混匀,从中吸取0.2 ml加入到第二管,以此类推,10倍梯度稀释,直到最后一管,做好标记,进行五组;采用同样的方法对CCU阳性标准品进行稀释,最为阳性对照,取未接种的一管作为阴性对照,置于37℃振荡培养14~16 d,根据颜色变化情况计算CCU含量。
三、结果
1.进行3次5组平行试验,试验结果见表1、表2、表3。
(备注:猪肺炎支原体P-5722-3株CCU阳性标准品检测区间值在0.2×108ccu50/ml~1×108ccu50/ml)
2.五种猪血清摇瓶试验结果。
1.三组平行试验数据无较大性偏差,数据可信,可作为参考性依据。
2.通过分别选择2各批次血清进行对照试验,降低批次间血清差异影响因素。
3.通过表1、表2、表3可以看出,猪肺炎支原体P-5722-3株使用进口1#猪血清制备的完全培养基培养效果最好。
四、小结与讨论
1.美国产进口1#猪血清与新西兰产进口2#猪血清批间差异较小,在培养上表现均较好,尤其是美国产进口1#猪血清最为突出。
2.国产4#猪血清较国产3#猪血清与国产5#猪血清要好,但其批间差异较大。
3.猪肺炎支原体P-5722-3株菌株不管在进口血清还是在国产血清中,连续三代培养呈现培养结果(CCU)上升趋势。
4.通过三组平行试验,验证了猪血清作为培养组分B在培养过程中的重要性,选择出最为适合猪肺炎支原体P-5722-3株菌株生长的猪血清。
表1 五种不同血清制备的完全培养基培养后一代菌液浓度测定
表2 五种不同血清制备的完全培养基培养后二代菌液浓度测定
表3 五种不同血清制备的完全培养基培养后三代菌液浓度测定