胶质母细胞瘤中EGFRv Ⅲ表达及对预后的影响

洪家康，李 鑫，王建祯



胶质母细胞瘤中EGFRv Ⅲ表达及对预后的影响

洪家康，李 鑫，王建祯

【摘要】目的 探讨表皮生长因子突变受体Ⅲ（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRv Ⅲ）在胶质母细胞瘤（glioblastoma，GB）中表达，研究影响患者预后的因素。方法 收集2012-01至2013-12的98例GB患者，通过免疫组化染色观察EGFRv Ⅲ在组织标本中表达情况，以性别、年龄、肿瘤体积、生长部位及卡氏评分（Karnofsky Perfomance Scale，KPS）等临床参数作为研究因素进行统计学分析。结果（1）免疫组化结果显示，EGFRv Ⅲ阳性表达率在GB病理标本和正常脑组织中分别为38.8％和0％。（2）单因素分析结果显示：EGFRv Ⅲ阳性组与阴性组中年龄、KPS评分差异有统计学意义（Χ2=7.018，P=0.008；Χ2=12.101，P=0.001）。（3）GB患者生存分析结果显示：EGFRv Ⅲ阴性组与阳性组的中位生存时间分别为13个月（95％CI，8.99～17.01）和12个月（95％CI，9.81～14.18）；在生存时间大于12个月患者中，EGFRv Ⅲ阴性组和阳性组的中位总生存时间分别为22个月（95％CI，16.91～27.09）和16个月（95％CI，14.04～17.95）；≥60岁和＜60岁两组，中位总生存时间分别为10个月（95％CI，6.73～13.27）和15个月（95％CI，11.90～18.10）。（4）Cox多因素分析KPS、EGFRv Ⅲ阳性表达是影响预后的独立相关因素。结论 EGFRv Ⅲ阳性表达、年龄和KPS评分是影响GB患者预后的危险因素。

【关键词】表皮生长因子突变受体Ⅲ；胶质母细胞瘤；预后

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GB）是恶性程度最高的神经上皮肿瘤之一，世界卫生组织将其分级为Ⅳ级。现行GB的标准化治疗方式主要包括手术、放疗及化疗等，但目前GB的治疗效果并不理想，预后较差。EGFRv是在GB发生发展过程中出现的众多分子遗传学改变之一［1］。EGFRv Ⅲ可以使肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡，并提升肿瘤细胞的活力和增加其对放疗和化疗的抵抗力，在GB的发生和发展过程有着重要作用［2］。但是EGFRv Ⅲ对于GB预后的临床意义尚未有定论，笔者将探讨EGFRv Ⅲ表达与临床参数的关系及其对GB临床预后的影响。

1　资料与方法

1.1一般资料 收集武警某院神经肿瘤外科2012-01 至2013-12所有进行GB手术患者的资料，符合条件98例。同时收集正常脑组织标本18例（正常脑组织标本由颅内减压术获得）。98例GB患者中男52例，女46例，年龄为39～78岁，平均（61.2±7.3）岁；正常脑组织的患者中男11例，女7例，年龄为25～73岁，平均（43.6±8.47）岁。所有组织标本均经由武警某院病理科诊断确认，4％甲醛固定后由石蜡包埋保存。所有临床标本采集与使用及随访资料的获得均由伦理委员会审核通过。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：（1）首次手术；（2）术后均行标准放化疗。排除标准：（1）复发GB患者；（2）术前已行放化疗；（3）术前已发现患有其他重大疾病。

1.3随访资料说明 通过阅读患者既往病历资料获得患者性别、年龄、肿瘤体积、生长部位及KPS评分（用于评估患者健康状况）等临床参数，通过电话或者邮件等随访方式获得GB患者的随访资料。统计随访获得90例GB患者的生存资料，通过EGFRv Ⅲ表达结果将其分为EGFRv Ⅲ阳性表达组与EGFRv Ⅲ阴性表达组，8例GB患者因失联导致资料丢失。随访起始时间为2013-12，截止时间为2015-12；至随访截止时间患者已因GB死亡为完全数据；仍存活在统计学上归为截尾数据；随访过程中丢失的患者和因其他原因死亡的患者归为截尾数据。得到随访资料的GB患者90例，随访率为91.8％。

1.4试剂 EGFRvⅢ兔抗人多克隆抗体（镇江博研生物公司，产品编号BYk-2558R），免疫组化试剂盒与二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液试剂盒（武汉博世德生物公司），均在有效期内使用。

1.5免疫组织化学方法 将4 μm石蜡切片脱蜡至水，加3％过氧化氢10 min阻断内源性过氧化物酶，山羊血清室温封闭20 min，滴加一抗，4 ℃孵育24 h，滴加二抗，三抗室温孵育各20 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。EGFRv Ⅲ阳性评判标准：阳性细胞率＞10％。

1.6统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料采用Χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。GB患者中的EGFRv Ⅲ表达阳性组与阴性组的生存分析采用Kaplan-Meier法比较中位生存时间进行分析。≥60岁的胶质母细胞瘤患者的多因素分析采用Cox多因素回归检验，计算OR值及其95％CI。

2　结果

2.1免疫组化结果 EGFRv Ⅲ染色主要定位于包膜与胞质，呈棕黄色。EGFRvⅢ在GB组织（图1A）和正常脑组织（图1B）标本的表达率分别为38.8％（38/98）和0％（0/18）。GB组织标本EGFRv Ⅲ阳性表达与正常脑组织标本比较，差异有统计学意义（Χ2=10.38，P=0.001）。

图1　胶质母细胞瘤组织和正常脑组织免疫组化染色结果（SP，x400）

2.2单因素分析 为明确GB预后的危险因素，将多相关因素进行单因素分析。结果发现年龄、KPS评分因素比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。性别、肿瘤发生的位置、是否为多发病灶、是否出现坏死因素比较，差异无统计学意义（表1）。

表1 胶质母细胞瘤临床病理指标与EGFRvⅢ表达的分析

2.3生存分析 采用Kaplan-Meier法对EGFRv Ⅲ阴性组与EGFRv Ⅲ阳性组中位生存时间进行比较分析。EGFRvⅢ阴性组与阳性组的中位生存时间分别为13个月（95％CI，8.99～17.01）和12个月（95％CI，9.81～14.18），见图2A。分析生存时间＞12个月的GB患者（48例），EGFRvⅢ阴性组和阳性组的中位总生存时间分别为22个月（95％CI，16.91～27.09）和16个月（95％CI，14.04～17.95），见图2B。 ≥60岁和＜60岁两组，中位总生存时间分别为10个月（95％CI，6.73～13.27）和15个月（95％CI，11.90～18.10），见图2C。2.4 Cox多因素分析 ≥60岁的GB患者，进行Cox多因素分析，发现KPS评分、EGFRvⅢ的表达是独立预后相关因素，KPS评分与生存时间的OR（95％CI）=0.452（0.228～0.896），EGFRvⅢ的表达与生存时间OR（95％CI）=2.118（1.052～4.263），见表2。

表2 EGFRvⅢ、KPS评分对预后的多因素分析

3　讨论

EGFR是一种相对分子质量为17 Ku的跨膜蛋白受体，其拥有调控正常细胞分化、增殖与凋亡的功能，同时参与肿瘤细胞的侵袭、转移和血管发生等［3］。EGFRvⅢ则是EGFR的常见突变体，与EGFR的完整结构相比，其胞外部分的2～7号外显子缺失，导致801个碱基对缺失，使外显子1和8相连接并融合产生一个新的氨基酸——甘氨酸，形成与野生型EGFR胞外区相比缺失6-273位氨基酸残基的突变，即EGFRv Ⅲ［4］。因其丧失胞外配体结合区，可在无配体结合情况下激活酪氨酸激酶，产生自体磷酸化实现持续激活，目前普遍认为这可以促进细胞增殖并抑制凋亡，因此使肿瘤组织增强对放疗和化疗的抵抗性，并增强细胞致瘤性和侵袭力，使其易发生早期转移［2］。在脑胶质瘤中常发生EGFR基因扩增和基因重排现象，EGFRv Ⅲ除存在于胶质瘤外，在乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌及前列腺癌等中均有发现。

胶质母细胞瘤为常见的中枢神经系统恶性肿瘤，传统的手术治疗及放化疗的疗效不佳，平均生存期也仅为60～70周［5］。EGFRv Ⅲ作为一种常见的突变形式，在胶质母细胞瘤中约占40％［4］。既往的研究中未见EGRFv Ⅲ在正常脑组织中表达［6］。EGFRv Ⅲ在正常脑组织中缺失，而在胶质母细胞瘤中高表达的特性，使其成为一个理想的治疗靶点［7］。研究显示，EGFRv Ⅲ靶向治疗措施如抗体、疫苗等已在体外细胞学试验和动物模型中显示出良好的抗肿瘤效应［8］。因此，针对EGFRv Ⅲ靶向治疗的药物开发具有广阔的应用前景。

笔者主要讨论了EGFRv Ⅲ与一些相关临床病理参数的关系，并对随访所得的资料进行了生存分析。研究证明，EGFRv Ⅲ增强GB肿瘤细胞的侵袭力，在GB的发生发展过程中有着重要作用，EGFRv Ⅲ是GB患者的不良预后因素，这与文献［9］结论一致。但Shinojima等［10］研究发现，EGFRv Ⅲ的表达及EGFR的扩增并不会影响患者的术后中位总生存时间，这与本研究的结论相符合。笔者认为EGFRv Ⅲ单独存在时并不能影响整体的生存时间，当EGFRv Ⅲ与其他一个或几个因子协同发挥作用时才能表现出它的负面效应。

单独分析术后生存时间超过12个月的患者，发现阳性组中位总生存时间明显低于阴性组。文献［11］表明，对于术后生存时间超过12个月胶质瘤患者EGFRvⅢ阳性表达水平是判断其复发及预后的有效指标，EGFRv Ⅲ阳性表达越高，其复发率也越高，预后也越差，与本文结论一致。说明EGFRv Ⅲ对预后的影响可能并不能在短时间内表现出来，在术后病程发展的过程中才会逐渐表现出其对预后的影响。

图2　EGFRv Ⅲ阴性组与EGFRv Ⅲ阳性组底Kaplan-Meier生存曲线

本研究发现年龄是影响患者生存时间的重要因素，EGFRvⅢ在不同年龄段的作用值得更进一步的研究。研究发现，儿童的GB相比于成人的GB，EGFR及其突变体的表达在临床意义上有明显不同［12］。研究认为EGFR基因扩增在成人的胶质瘤中常见，但在儿童胶质瘤中EGFR及其突变体非常少见也没有明显的作用［13］。成人的胶质瘤患者中，EGFR基因扩增及EGFR突变体的表达在不同的年龄段中也发挥着不同的作用［14］。通常年龄越大的GB患者预后越差，本研究中EGFRv Ⅲ阳性表达并不影响整体GB患者的预后生存时间，但是EGFRv Ⅲ在≥60岁的GB患者中有着更高的表达，同时多因素相关分析表明EGFRv Ⅲ是≥60岁的GB患者的独立预后相关因素。其高表达对≥60岁患者产生不良的预后。KPS评分也是影响预后的重要指标。KPS功能状态评分标准，得分越高，健康状况越好，越能忍受治疗给身体带来的不良反应，因而也就有可能接受彻底的治疗。得分越低，健康状况越差，若低于60分，许多有效的抗肿瘤治疗就无法实施。

本研究中存在的不足之处有：研究对象均为经手术治疗的GB患者，而忽略了那些不能接受手术治疗的患者，因此研究结果仅能代表接受手术的患者，而在面对所有GB患者时，结果并不一定准确。另一方面因为本研究中患者样本数量并不多，所以可能会对实验结果的准确性产生影响，如果能够收集到更多的样本数据，生存分析的结果将更有说服力。客观上由于不同的抗体及检测技术、不完全的临床资料、病理诊断的主观性、评估标准的差异、肿瘤异质性或者存在其他的生物学异常等等，也会与同类研究在研究结果上存在差异。

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（2016-02-23 收稿2016-05-23 修回）

（责任编辑宋宫儒）

Prognostic effect of epidermal growth factor receptor variant Ⅲ in glioblastoma

HONG Jiakang，LI Xin，and WANG Jianzhen. Department of Neurosurgery，Generl Hospital of Chinese People's Armed PoliceForces，Beijing 100039，ChinaCorresponding author：WANG Jianzhen，E- mail：wangjianzhen200588@163.com

【Abstract】Objective To investigate the influence of epidermal growth factor receptor variant Ⅲ（EGFRvⅢ）expression on the prognosis of patients with glioblastoma.Methods A total of 98 patients with glioblastoma were enrolled into this study from January 2012 to December 2015.The expression levels of EGFRv Ⅲ were detected by immunohistochemistry and analyzed their association with clinical parameters such as gender，age，tumor size，growth site and Karnofsky Performance Scale（KPS），etc.Results（1）The positive rate of EGFRv Ⅲ was 38.8％ in 98 cases of patients but 0％ in the normal.（2）Single factor analysis showed that age，KPS were statistically significantly different between EGFRv Ⅲ positive and negative groups（Χ2=7.018，P=0.008；Χ2=12.101，P=0.001）.（3）Survival analysis results showed that median survival time was 13 months（95％CI，8.99-17.01）in EGFRv Ⅲ negative group and 12 months（95％CI，9.81-14.18）in EGFRv Ⅲ positive group；the median total survival time over 12 months was 22 months（95％CI，16.91-27.09）in EGFRv Ⅲ negative group and 16 months（95％CI，14.04-17.95）in EGFRv Ⅲ positive group；the median total survival time was 10 months（95％CI，6.73-13.27）in patients over 60 years old and 15 months（95％CI，11.90-18.10）in patients under 60 years old.（4）Cox multiple factors analysis showed that KPS and positive expression of EGFRv Ⅲ were independent correlative factor of disease prognosis.Conclusions Positive expression of EGFRv Ⅲ，age and KPS are the risk factors influencing the prognosis of patients with glioblastoma.

【Key words】epidermal growth factor receptor variant Ⅲ；glioblastoma；prognosis

【中国图书分类号】R730.264

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.06.004

作者简介：洪家康，硕士研究生在读，E-mail：376459319@qq.com

作者单位：100039 北京，武警总医院神经肿瘤外科

通讯作者：王建祯，E-mail：wangjianzhen200588@163.com