转录因子Klfs家族影响肝细胞癌发生发展的机制研究进展*

董笑　李琦



转录因子Klfs家族影响肝细胞癌发生发展的机制研究进展*

董笑李琦

摘要肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，其发生与发展的具体分子机制尚不明确。Krüppel样因子家族（Klfs）是具有锌指结构的高度保守的转录因子家族，共包括17个家族成员。近年来，关于Klfs与肝癌发病机制的研究不断深入，发现Klf2、Klf4、Klf5等家族成员参与肝癌细胞的增殖、分化和浸润转移等过程。本文就Klfs家族成员的功能以及在肝癌发生发展中的作用机制进行综述。

关键词转录因子Krüppel样因子肝细胞癌抑癌基因癌基因

作者单位：上海交通大学附属第一人民医院肿瘤中心（上海市200080）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81272714，81572310）资助

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，预后极差，据WHO统计，2012年占恶性肿瘤死亡率第2位，50%以上的肝癌病例发生在中国［1］。肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌病理类型，占肝癌总数的75%～80%。虽然已有研究表明，HGF/c-MET、RAF/MEK/ERK等信号通路的活化参与了HCC的发生、侵袭和转移［2］，但这些通路的上游转录调控机制尚不明确。

1 HCC演进过程中的可能分子机制

HCC的演进是一个复杂、长期、多因素参与的过程，其中涉及的分子机制可能包括：1）间质微环境的改变：如细胞外基质组成成分的改变及蛋白水解酶活力的增强；2）肿瘤相关基因的突变：如p21、p53基因等；3）细胞信号通路异常：如影响细胞分化和发育的Hedgehog通路；影响细胞增殖的HGF/HGFR、RAS/ RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路；影响肿瘤上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程的Wnt/β-catenin通路、VEGF/VEGFR通路等。而Klfs家族作为这些通路的上游转录调控分子，在肝癌的发生与发展过程中发挥重要的作用。

2 肝癌相关Klfs家族的结构和功能

Klfs家族相同的结构特点为羧基末端具有高度保守的串联的C2H2锌指结构，由2个半胱氨酸和2个组氨酸残基构成，通过锌指结构结合到目标靶基因序列上相似的GC/GT/CACCC位点，发挥特定的基因转录调控功能。而Klfs家族的氨基末端大都不同，可以结合不同的激活因子与抑制因子，这就导致了Klfs家族成员功能的多样性。Klfs家族成员通过转录调控下游靶基因的表达而在细胞生长、增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用。目前，已报道共有7个Klfs家族成员（Klf2、Klf4、Klf5、Klf6、Klf8、Klf9、Klf17）参与肝癌的发生与进展［3-9］。

2.1 Klf4与肝癌

Klf4主要在胃肠道、血管内皮细胞中表达，故称“胃肠富集型Klf”。在不同的肿瘤中，Klf4发挥不同的调节作用。在食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌等多种肿瘤中，Klf4发挥抑癌基因的作用［10-14］。研究表明Klf4主要通过以下机制发挥抑癌基因作用：1）抑制Wnt/β-catenin信号通路［15］；2）上调Notch通路抑制肿瘤的发生发展［16］；3）抑制肿瘤EMT［14］：此过程涉及多种信号通路，主要包括ERK通路活化、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信号通路、NF-κB通路、VEGF通路、TGF-β等，参与APC信号转导通路；4）诱导肿瘤干细胞增殖［17］；5）激活p53、p21等抑癌基因［18］。

Klf4的表达水平与肝癌细胞分化程度相关。Hsu等［18］发现高分化肝癌细胞中细胞增殖指数Ki-67更低，Kaplan-Meier分析显示Klf4高表达的肝癌细胞分化程度较高且5年生存率较高。Sun等［4］研究表明Klf4通过诱导核因子6（HNF6）表达提高肝癌细胞分化能力。Zhou等［19］构建特征性Klf4非编码转录体即Klf4-003，其表达下降与肝癌复发相关，去甲基化处理后可恢复Klf4-003的表达。

Klf4通过上调下游靶基因及金属蛋白酶的表达抑制EMT过程。Sureban等［20］证实敲除肝癌细胞中的肿瘤干细胞标记物DCLK1（tumor stem cell marker double cortin-like kinase1）后，Klf4表达下降，同时EMT过程的抑制因子miR-200家族表达下降；Klf4被诱导过表达后，miR-200家族成员miR-200a、miR-200b、miR-200c表达明显升高，其机制为Klf4基因可直接与miR-200家族启动子区结合，转录调控miR-200家族的表达。Sung等［21］首次证实在具高度侵袭性的肝癌细胞中过表达Klf4后，金属蛋白酶抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达上调，抑制EMT过程。Li等［11］在肝癌的研究中发现，Klf4是一种抑癌基因，转染Klf4基因的肝癌细胞增殖明显受到抑制，亦影响了EMT相关标记物的表达。Klf4基因还通过结合维生素D3受体（VDR）启动子区，直接转录调控VDR基因的表达。Klf4基因外显子区域高甲基化导致其表达缺失，抑制了VDR的表达活性，使VitD3-VDR抗肝癌细胞增殖效应的作用下降，影响了肝癌的发生、侵袭和转移等生物学特性。

2.2 Klf6与肝癌

2.2.1 Klf6结构的特殊性Klf6基因位于10p15，由4个外显子构成，除羧基末端3个高度保守的锌指结构域外，氨基末端还包含1个丝氨酸/苏氨酸富集及1个酸性结构域，具有转录激活功能。Klf6在胎盘中高度表达，被认为是癌胚抗原基因家族。Klf6基因有3个剪接变异体（SV1、SV2、SV3）。在前列腺癌、神经胶质细胞瘤、结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤中Klf6是一种肿瘤抑制因子，不同的剪接变异体可以在不同肿瘤的起源、发展过程中发挥不同作用［22-23］。

2.2.2 Klf6在肝癌中的调节机制Klf6 SV1在肝癌组织中表达升高，被认为是促癌基因［24-25］，而Klf6 SV2的作用仍存在争议。Zhou等［6］研究发现，在肝癌组织及细胞系中，Klf6 SV2表达水平较正常组织中升高。Sirach等［26］研究发现，Klf6基因敲除后，肝癌细胞中Rb磷酸化水平和Bcl-xL表达明显被抑制，从而产生抗细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。由于此研究使用的siRNA序列与野生型Klf6及其变异体相似，故敲除Klf6基因产生的抗癌作用应归因于SV1的非特异性敲除。另外，其他大多数研究表明野生型Klf6、Klf6 SV2是抑癌因子，在肝癌组织及细胞系中发挥抗细胞增殖、促进细胞凋亡的作用［23，27-30］。

Klf6可调节多种参与肝癌发生和发展过程中的基因。研究表明，野生型Klf6和Klf6 SV2可以增强其下游靶基因p21的表达，发挥抑癌作用［31］，而SV1抑制p21的表达，促进癌细胞增殖［32］。Liang等［24］发现Klf6-FL（full-length）可以抑制肿瘤细胞增殖、迁移，而SV1与其有相反作用。利用生物学及荧光素酶标记法筛查出Klf6-FL是miR-1301和miR-210的靶基因，肝癌组织标本中存在miR-1301过表达及miR-1301基因甲基化和乙酰化。Lee等［27］研究发现Klf6基因抑制癌基因PTTG1转录过程。敲除Klf6后，因PTTG1表达上调导致肝癌细胞增殖。Tarocchi等［29］发现Klf6抑制MDM2蛋白的表达，并下调p53基因的活性或减少p53基因的表达，发挥抑制肿瘤生长的作用。

2.3 Klf8与肝癌

目前的研究表明Klf8是肝细胞癌的促癌基因［7，33- 34］。Han等［33］认为肝癌浸润及转移首先是MMPs等基质金属蛋白酶降解细胞外基质，进而癌细胞通过EMT过程从原发病灶脱离，进入周围组织和血液、淋巴循环，发生浸润和转移。MMP-9是MMP家族中的一员，具有降解变性胶原和Ⅳ型胶原蛋白的功能，与肝癌的进展及低生存率密切相关。研究显示，Klf8蛋白表达水平与MMP-9含量呈正相关［33］，这表明MMP-9可能是Klf8的下游靶基因，上调Klf8基因的表达导致肝癌细胞株MMP-9的活性增加，促进癌细胞的浸润及转移。相关研究发现，肝癌组织Klf8的表达水平与黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）表达水平呈正相关［33］，FAK基因过表达可促进肝癌的转移，这表明Klf8可能受FAK调控，但具体信号通路机制尚不明确。成撒诺等［34］研究表明Klf8基因在肝癌中参与调控血管生成，即Klf8通过PI3K/ AKT信号通路诱导VEGF的表达，Klf8高表达的肝癌细胞具有更强的诱导新血管生成潜能。Yang等［7］研究发现Klf8及β-catenin蛋白表达水平在高分化肝癌中显著升高，进一步研究提示Klf8参与了肿瘤浸润和转移过程中的重要信号通路-Wnt/β-catenin的转录调控。一方面，Wnt3a可以刺激Klf8表达水平升高；另一方面Klf8过表达提高了β-catenin对TCF4（T-cell factor 4）转录因子的招募能力，进而诱导Wnt/β-catenin信号通路靶基因c-Myc、cyclin D1及Axin1表达。

2.4 Klf17与肝癌

Liu等［9］分析了60例肝癌组织中Klf17表达水平与生存率之间的关系，结果显示Klf17高表达、低表达患者5年生存率分别为63%、41%（P=0.034）。Klf17低表达组中，发生淋巴结及远处转移的概率更高。Sun等［35］发现miR-9过表达促进肝癌细胞转移和浸润，HepG2肝癌细胞中miR-9表达水平较正常肝细胞增高1 000倍，利用荧光素酶分析显示miR-9通过结合Klf17基因3'UTR抑制Klf17基因表达，共转染miR-9后，Hep12肝癌细胞中Klf17蛋白表达下调；抑制miR-9表达后，则Klf17蛋白表达上调。Klf17直接结合波形蛋白、ZO-1、S粘连蛋白的启动子区域，通过上皮间质转化过程，抑制肝癌浸润与远处转移。

3 Klf家族的其他因子与肝癌

3.1 Klf2与肝癌

有关Klf2基因与肝癌的关系研究甚少。Huang等［3］研究显示，Klf2基因过表达可以抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡。长链非编码RNA（LncRNA）TUG1在肝癌组织中表达上调，通过结合EZH2和SUZ12抑制Klf2转录过程。

3.2 Klf5与肝癌

Shibata等［36］利用全基因测序方法，发现10%～30%肝癌细胞中存在Wnt/β-catenin信号通路的关键调节因子CTNNB1外显子的突变，CD44和c-Myc蛋白恰是CTNNB1外显子的作用靶点，此通路的异常活化促进肝癌细胞的生长。Klf5基因可以间接调节肿瘤干细胞（cancer stem-like cells，CSCs）标志物CD44表达，促成CSCs的恶性生物学行为［36-37］。Liu等［38］进一步提出在肝癌细胞株MHCC97的侵袭与远处转移过程中存在c-Myc/miR-17-5p反馈环路。

3.3 Klf9与肝癌

据Fu等［39］报道，肝癌组织中Klf9 mRNA及Klf9蛋白表达水平均降低，HepG2细胞中Klf9表达上调具有抗增殖、促凋亡的作用。程序性死亡蛋白5 （PDCD5）作为一个凋亡促进因子，可以直接与Klf9基因启动子区3'端的131～692 bp结构域结合继而上调Klf9的表达。Klf9高表达的患者不易发生淋巴结转移。Sun等［8］研究发现，Klf9基因可结合p53基因启动子而上调p53表达水平。该研究的动物实验亦证实Klf9过表达可明显抑制肝癌的发展。以上研究均表明Klf9基因在肝癌的发生与发展过程中发挥抑癌作用。

4 前景与展望

目前关于Klf家族在肝癌发生与发展过程中调控网络的研究并不全面，Klf的17个家族成员中仅7个成员与肝癌相关。而这7个成员之间的相互作用机制尚不明确，亦缺乏有关其他成员在肝癌演进过程中的研究。另外，关于miRNA、LncRNA与Klf家族的关系亦缺乏深入探讨。期待发掘其他参与肝癌进展的Klf家族成员，这可能为肝癌的分子诊断和药物诊疗提供新的方向。

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（2016-01-12收稿）

（2016-03-30修回）

Mechanism of transcription factors KLFs in the occurrence and development of HCC

Xiao DONG, Qi LI
Correspondence to: Qi LI, E-mail: Leeqi2001@hotmail.com
Department of Oncology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200080, China
This work was supported by the Natural Science Foundation of China (No.81272714 and 81572310)

AbstractHepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most lethal human cancers in China.The specific molecular mechanism of its occurrence and development is unclear.Krüppel-like factor family (KLF), which includes 17 members, is a highly conserved transcription factor family with zinc finger structure.The mechanism of KLFs and the pathogenesis of HCC have been studied in recent years.Research revealed that KLF2, KLF4, KLF5, and other KLF family members could be involved in the progression of proliferation, differentiation, invasion, and metastasis of HCC.This review summarizes the function and the mechanism of transcription factors KLF in the occurrence and development of HCC.

Keywords:transcription factors, Krüppel-like factor, hepatocellular carcinoma, tumor suppressor gene, oncogene

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.08.047

通信作者：李琦Leeqi2001@hotmail.com

作者简介

董笑专业方向为肿瘤分子靶向治疗。

E-mail：dongxiao92@outlook.com

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