樟树4捕磷酸胞苷2睠布谆睤渤噢捍技っ富因的克隆及表达分析

荆礼 郑汉 姚娜 陈美兰 申业 黄璐琦

[摘要]4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase，CMK）是植物萜类化合物生物合成途径甲基赤藓醇4磷酸途径（methylerythritol4phosphate pathway，DXP/MEP）上的第4个关键酶。该研究根据樟树转录组数据，利用RTPCR（reverse transcriptionPCR）方法从药用植物樟树Cinnamomum camphora中克隆得到4二磷酸胞苷2C甲基 D赤藓醇激酶基因，命名为CcCMK1（GeneBank登录号 Ku376098），对其序列进行生物信息学分析，结果表明该基因开放阅读框（ORF）为1 212 bp，编码403个氨基酸，推测其相对分子质量为4446 kDa，等电点（theoretical pI）为499。跨膜结构分析表明CMK蛋白不存在跨膜结构。信号肽分析表明其为非分泌蛋白，不存在信号肽。亚细胞定位表明其定位于叶绿体中。利用荧光实时PCR检测了龙脑樟、油樟、芳樟、脑樟和异樟5种化学型樟树中CcCMK1基因的表达量，结果表明CcCMK1基因在油樟中的表达量最高，龙脑樟中表达量最低，为樟树萜类化合物生物合成途径关键酶基因元件挖掘提供研究基础。

[关键词]樟树；4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇激酶（CMK）；基因克隆；生物信息学分析；表达分析

[Abstract]The 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase was the fourth key enzymes in plant terpenoid biosynthesis pathway of methyl erythritol phosphate pathway（MEP） According to the study of Cinnamomum camphora transcriptome data，we abtained the 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase gene using RTPCR，and named CcCMK1，then deposited it in GeneBank（Accession number： Ku376098）Bioinformatics analysis showed the open reading frame （ORF） of the CcCMK1 was 1 212 bpThe putative protein encoded 403 amino acids，and its molecular weight was 4446 kDa and theoretically isoelectric point was 499Transmembrane structure analysis showed that there was no transmembrane structure Signal peptide analysis showed that it was a non secretory protein， and there was no signal peptide The subcellular localization showed that the chloroplast was located in the chloroplastAnalysis of the expression of CcCMK1 gene in five chemotypes of C camphora using Realtime PCR showed its expression level was highest in C longepaniculatum， and the lowest in Borneol camphorThis research provided a basis for characterizing the key enzyme genes of terpenoid biosynthetic pathway in C camphora

[Key words]Cinnamomum camphora； 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase（CMK）； gene cloning； bioinformation analysis； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20160902

樟樹Cinnamomum camphora （L） Presl不仅是一种常见的药用植物，还是一种含天然精油的经济植物。樟树的根、树皮、叶子和果实均可入药，可诊疗感冒头痛，风湿骨痛，胃腹冷痛等疾病。樟树的枝、叶可提取樟脑和樟油，在医药及香料工业具有极高的经济价值。

樟树中有效药用成分为挥发油类物质，如龙脑、樟脑、芳樟醇、水芥烯、榄香烯等，樟树挥发油类化学成分以及樟树化学类型之间化学成分种类和含量的研究已有大量报道[13]。近年，随着新一代测序技术的广泛应用，人们从基因组、转录组角度对樟树进行研究。江香梅等以樟树5种化学型的叶片为材料，进行了转录组分析[4]，共注释55 955条unigene，其中424条unigene参与单贴、二萜、倍半萜和萜类骨架合成。Shi等做了蔗糖诱导的樟树体细胞胚的比较转录组工作，注释了114 229条unigene，发现了897个基因可能参与了体细胞胚的发生[5]。目前，从樟树中克隆的基因并不多。李永鹏等利用同源克隆方法，从香樟克隆得到actin基因[6]。张力维等同样利用同源克隆方法，克隆到香樟延伸因子EF1a基因片段[7]。Yang等从细毛樟C. tenuipilum中克隆得到一个香叶醇合成酶基因CtGers，并对其功能进行验证[8]。

挥发油类的主要成分大多为萜类化合物，萜类化合物在植物体内通过2条途径独立合成，即位于细胞质的甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA）[9]和位于质体中的脱氧木酮糖5磷酸途径（1deoxyDxylulose5phosphate pathway，DXP）或甲基赤藓醇4磷酸途径（methylerythritol4phosphate pathway，MEP）[10]。CMK，即4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritolkinase），是MEP途径中的第4个酶促反应所需的酶，是萜类合成的MEP途径中唯一的一个激酶，它可以4二磷酸胞苷2C甲基赤藓醇（4diphosphocytidyl2Cmethylerythritol，CDPME）为底物生成4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇2磷酸（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol2phosphate，CDP_ME2P），经一系列反应后生成2条独立途径的共同中间体异戊烯基二磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）[11]，IPP在异戊烯基二磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）的作用下部分转化为双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），这2种物质均是所有萜类化合物的前体物质。目前，已经从药用植物丹参[12]、杜仲[13]、雷公藤[14]中成功克隆得到CMK基因，但尚未从樟树中克隆得到萜类化合物生物合成MEP途径的酶基因。

本研究基于樟树转录组数据库中CMK基因序列，通过 RTPCR 技术成功地从樟叶片中扩增到CcCMK1基因的cDNA，并进行生物信息学分析，同时利用实时荧光定量方法分析芳樟、异樟、油樟、脑樟、龙脑樟5种化学型樟树中CcCMK1基因的表达量，以期为樟树主要药效成分挥发油类生物合成途径的解析提供一定参考 。

1材料

11植物

樟树（龙脑樟、脑樟、芳樟、油樟、异樟）均采集自江西省龙脑樟繁殖基地（欧阳少林教授惠赠），置于中国中医科学院中药研究所温室中生长。

12仪器

9700实时荧光定量 PCR仪（ABI公司），TF 7500型Real Time PCR System（ABI公司），5810R 型低温冷冻离心机（Eppendorf 公司），MM400冷冻混合研磨仪（Retsch公司），NanoDrop2000分光光度计（Thermo Scientific），紫外凝胶成像分析仪（Gene 有限公司）。

13试剂

RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司；Oligo（dT）18，10 mmol·L-1 dNTP，5×Reaction Buffer，RiboLock RNase Inhibitor，RevertAid Reverse Transcriptase购自赛默飞世尔科技（中国）；DL 2 000 DNA Marker，Ex Taq，SYBR Premix Ex TaqTM购自Takara有限公司；T4 DNA连接酶，pGEMT Easy 载体购自普洛麦格生物技术有限公司。

2方法

21总RNA的提取和cDNA的制备

采用华越洋核酸提取试剂盒，按照说明书提取樟叶片的总RNA，使用NanoDrop2000分光光度计进行RNA浓度和质量检测，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。采用RTPCR方法，按以下体积进行反转录合成CcCMK1的cDNA： RNA 1 μg，Oligo（dT）18 1 μL，加ddH2O至12 μL，65 ℃加热5 min，产物置于冰上冷却；待产物冷却后，加入5×Reaction Buffer 4 μL，10 mmol·L-1 dNTP 2 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL，混匀，42 ℃加热1 h，70 ℃加热5 min，产物置于冰上冷却，即为单链cDNA，于-20 ℃保存，用于基因克隆和表达分析。

22CMK1基因cDNA的全长克隆

根据CcCMK1基因最大开放阅读框（ORF）设计引物，CMKL：5′CAACATGGCTGCCACCCAATTCC3′；CMKR：5′GACATTACTTAAATGGACAAGCGGTC3′。按以下體积进行PCR：LA Taq 05 μL，10×LA taq BufferⅡ5 μL，25 mmol·L-1 dNTP 4 μL，cDNA 1 μL，Primer L 08 μL，Primer R 08 μL，加ddH2O至50 μL，反应条件为：94 ℃预变性5 min，然后进行30个循环：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温，对PCR产物进行1%琼脂糖电泳检测；选取在1 200 bp左右产生条带的PCR产物，按以下体积同pGEMT easy vector连接：T4 DNA连接酶的 2×快速连接缓冲液 5 μL，pGEMT Easy vector 1 μL，PCR产物2 μL，T4 DNA连接酶1 μL，加ddH2O至10 μL，反应条件为：22 ℃保温10 min。将连接产物热激发转化至大肠杆菌DH5α，氨苄抗性筛选，用M13引物进行菌落PCR后选择阳性克隆送至上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司进行测序。

23CcCMK1的生物信息学分析

利用NCBI 的 ORF Finder 分析该CcCMK1基因的最大开放阅读框（ORF）；利用InterProScan（http：//wwwebiacuk/interpro/）分析蛋白的理化性质[15]；利用TMHMM Server v20（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）预测跨膜结构[16]；利用SignalP 41 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）进行信号肽分析[15]；利用TargetP11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）进行亚细胞定位；利用SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/）进行结构域的三维建模[15]；利用DNAMAN进行多重序列比对及二级结构分析；利用MEGA 6进行系统进化树的构建，bootstrap重复1 000次。

24不同化学型樟树中CMK1基因表达量的分析

采用华越洋核酸提取试剂盒，按照说明书提取不同化学型樟树叶片的RNA，采用RTPCR方法获得不同化学型樟的cDNA。采用DNAMAN设计RealTime PCR引物，CMK1realtimeL：5′GAAGTCTTACCGTCTCTGAAACG3′；CMK1realtimeR：5′CACTGGTTCTCTTCCCGAGTGAG3′； actinrealtimeL：5′CCAGCCTTCACTCATTGGAATGG3′； actinrealtimeR：5′CTGTACTTCCTTTCTGGTGGTGC3′。进行RealTime PCR检测不同化学型樟中CMK1基因的表达量，所用仪器为ABI公司TF 7500型Real Time PCR System，反应体系为：cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL，PrimerL 02 μL，PrimerR 02 μL，ROX（Ⅱ）02 μL ，ddH2O 34 μL ，PCR 反应条件为： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s。每个样品进行3次生物学重复，数据采用2-ΔΔCT公式进行分析。

3结果

31 CcCMK1基因cDNA的全长克隆

基于转录组数据库中CMK1基因序列，在最大开放阅读框上下游设计引物，对cDNA进行扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，见图1，显示在1 212 bp左右产生明亮、单一的条带，与转录组基因库中CMK1基因大小一致；将PCR产物同pGEMT Easy载体相连，热激法转化至大肠杆菌DH5α中，氨苄抗性筛选阳性克隆，见图2。在1 400 bp左右产生明亮单一的条带，选择阳性菌落，利用pGEMT Easy载体通用引物SP6和T7测序，测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，显示该序列为CMK基因家族成员，表明CcCMK1克隆成功。

32CcCMK1的生物信息学分析

321CcCMK1蛋白基因的理化性质利用InterProScan（http：//wwwebiacuk/interpro/）对CcCMK1蛋白的理化性质进行分析，推测其结构式为C4886H8193N1581O2064S324，相对分子质量为4446 kDa，等电点 （theoretical pI）为499，该蛋白的不稳定系数 （instability index） 为4283，说明其较为稳定，脂肪系数 （aliphatic index） 为2758，亲水性系数 （grand average of hydropathicity， GRAVY）为0710。利用TMHMM Server v20（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构，结果表明其位于膜外，不存在跨膜结构。利用SignalP 41 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）进行信号肽分析，结果表明其为非分泌蛋白，不存在信号肽。利用TargetP11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）进行亚细胞定位，结果表明其定位于叶绿体中，与其他MEP途径上的蛋白定位相一致[1718]。

322CcCMK1蛋白多重序列比对及系统进化树的构建选取与CcCMK1蛋白亲缘关系较近的4条蛋白序列，利用DNAMAN进行多重序列比对，结果见图3。CcCMK1蛋白与其他物种的CMK蛋白同源性为7775%，并含有GHMP激酶家族的高度保守氨基酸序列：PXXXGL（G/S）SS（A/G）XX1225（K/R）（图3中黑线所示），此家族还包括半乳糖激酶、高丝氨酸激酶、甲羟戊酸激酶和磷酸甲羟戊酸激酶[19]。

323CcCMK1蛋白的二级结构及三级结构预测CcCMK1基因最大开放阅读框含有1 212 bp，预测编码403个氨基酸。利用DNAMAN分析该蛋白的二级结构，该蛋白的二级结构中α螺旋占67%、β折叠占33%、无规则卷曲占 159%。蛋白的功能与其结构密切相关，利用SWISSMODEL进行结构域的三维建模，以大肠杆菌4二磷酸胞苷 2C甲基 D赤藓醇激酶三斜晶型（2ww41）为模板，其序列相似性为033，覆盖率为066，覆盖范围为93～388位氨基酸，结果见图3。InterProScan搜索蛋白质结构域，结果显示其具有IspE（CMK）功能结构域，并属于GHMP激酶家族，与之前多重序列比对结果相一致。IspE来源于结核分枝杆菌，是MEP途径上的一种酶，是这种致病细菌生存所必需的酶。它可以在ATP存在的情况下，催化4diphosphocytidyl2Cmethylderythritol （CDPME）生成4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol 2phosphate （CDPME2P） [20]。

33不同化学型樟树中CcCMK1基因表达模式分析

在同一时间，采集在相同条件下生长的不同化学型樟树的叶片，称取100 mg，采用华越洋核酸提取试剂盒，按照说明书步骤提取芳樟、异樟、油樟、脑樟及龙脑樟叶片的RNA，使用NanoDrop2000分光光度计检测RNA含量，采用RTPCR方法使用1 μg RNA获得不同化学型樟的cDNA，将cDNA稀释20倍，-20 ℃保存待用。利用DNAMAN设计樟树CcCMK1和actin基因的实时荧光定量引物，进行实时荧光定量检测，结果见图6。CcCMK1基因在油樟中表达量最高，在龙脑樟中表达量最低。

4讨论

樟树C. camphora是樟科Lauraceae樟属Cinnamomum植物，是我国传统的药用植物，具有悠久的药用历史，其主要药用成分为萜类物质挥发油，有祛风散寒、理气活气、止痛止痒、强心镇痉和杀虫等功效。樟属植物具有明显的种内化学变异的现象，即由于化学成分的差异分化出不同化学型，樟树划分为芳樟（主成分芳樟醇）、脑樟（主成分樟脑）、油樟（主成分桉油素）、龙脑樟（主成分龙脑）和异樟（主成分异橙花叔醇）等化学型[21]。刘星星等对不同化学型樟树叶挥发性成分组成进行多变量分析，静态顶空气相色谱质谱联用法（SHSGCMS）的测定结果表明， 从25个样品中共鑒定出171种化合物[1]，其中，β芳樟醇、莰烯、β愈创木烯、γ松油烯、α侧柏烯、2乙基呋喃、α石竹烯和大牛儿烯8种化合物在所有样品中均可检测到。5种化学型樟树叶挥发性成分种类及其含量存在较大差异。对12种成分进行主成分分析表明，β愈创木烯、2乙基呋喃、α石竹烯、大牛儿烯、δ荜澄茄烯、己醛和可巴烯7种挥发性成分是5种化学型樟树分类的重要判定变量。

随着功能基因组技术的发展和完善，人们迫切从基因组学角度揭示导致樟属种内的化学型差异的分子生物学机制等问题，利用Illumina测序技术对樟树5种化学类型叶片转录组进行测序、组装共获得156 278个unigene，序列平均长度584 bp，共有3580%的unigene获得了基因注释， 其中1019%的基因注释到次生代谢生物合成途径，参与单萜、二萜、倍半萜和萜类骨架的合成 [5]。目前为止，已经从樟树中克隆得到6个基因的全长，其中只有1个基因属于单萜合酶家族成员，即Yang Tao等从细毛樟中克隆得到1个香叶醇合酶基因CtGerS[8]。4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇激酶CMK是萜类物质共同合成途径之一质体MEP途径中的第四步催化反应的酶，也是MEP途径中唯一的激酶，有关CMK基因相关报道较少。在大肠杆菌中克隆了1个CMK家族成员IspE，编码1个约31 kDa大小、含有233个氨基酸的多肽，其属于保守的GHMP激酶家族[22]。重组IspE在大肠杆菌中具有4二磷酸胞苷2C甲基赤藓醇激酶活性，在ATP存在的情况下，催化4二磷酸胞苷2C甲基赤藓醇生成4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇2磷酸[22]。

本文首次克隆得到樟树中4二磷酸胞苷2C甲基D赤藓醇激酶CMK基因（CcCMK1）的cDNA，并进行了全面的生物信息学分析，CcCMK1是CMK家族基因并具有IspE功能结构域，与其他物种的CMK基因有高度同源性。对不同化学型樟树中CMK1基因的表达量进行了分析，结果显示油樟中CcCMK1基因的表达量最高，江香梅等对单萜合成的代谢通路中9条可能编码芳樟醇合成酶unigene的表达分析结果显示，芳樟醇合成酶基因在芳樟化学类型中表达水平高， 而在油樟化学类型中表达水平较低[7]。由此可见，樟树不同化学型中萜类物质生物合成途径不同阶段的酶含量可能不同，需要更深入的研究才能揭示其本质差别。本研究中CcCMK1基因的克隆和表达分析仅为药用植物樟树萜类物质合成途径解析提供了基本基因元件。

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