醒脑静注射液HPLC特征图谱研究

2016-07-09杨立新冯伟红夏伯候林丽美刘薇薇苗婉清甘国锋邹济高李春

中国中药杂志 2016年9期

杨立新冯伟红夏伯候林丽美刘薇薇苗婉清甘国锋邹济高李春

[摘要]该研究采用高效液相色谱法建立并分析了不同厂家生产醒脑静注射液的特征图谱。采用Thermo BDS Hypersil C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）进行分离，流动相为乙腈002%甲酸水溶液，梯度洗脱，流速10 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL。通过对29批醒脑静注射液的HPLC特征图谱研究，共标定了11个特征峰。经与对照品对比，指认出其中7个特征峰的结构，分别为优香芹酮、樟脑、姜黄烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮和吉马酮。运用计算机辅助相似性评价系统及主成分分析对所建29批醒脑静注射液的HPLC 特征图谱进行分析比较，结果显示不同厂家生产的醒脑静注射液能明显分为3类。该文所建立的HPLC 特征图谱为科学评价和有效控制醒脑静注射液质量提供了依据。

[关键词]醒脑静注射液；特征图谱；主成分分析；高效液相色谱法

[Abstract]To establish and analyze the HPLC specific chromatograms of Xingnaojing injection manufactured by different factories The separation was performed on a Thermo BDS Hypersil C18 column （46 mm×250 mm， 5 μm）， with the mobile phase consisting of acetonitrile002% formic acid aqueous solution for gradient elution The flow rate was 10 mL·min-1， and the column temperature was 35 ℃ The detection wavelength was set at 254 nm， and the sample size was 20 μL Eleven chromatographic peaks were identified as characteristic peaks of HPLC specific chromatograms of Xingnaojing injection， after analyzing 29 batches of Xingnaojing injection samples Compared with the reference substances， seven of them were identified as eucarvone， camphor， curcumenone， curcumenol， curdione， curzerenone and germacrone， respectively HPLC specific chromatograms of Xingnaojing injection manufactured by three factories could be easily classified into three categories after investigation with computeraided similarity evaluation system combined with principal component analysis The established HPLC specific chromatograms provide a basis for scientific evaluation and effective control of the quality of Xingnaojing injection

[Key words]Xingnaojing injection； specific chromatograms； principal component analysis （PCA）； highperformance liquid chromatography （HPLC）

doi：10.4268/cjcmm20160912

指紋图谱技术在中药注射剂标准提高中的应用日趋成熟，对保障药品的有效、均一具有重要的意义。2010 年版《中国药典》实施后至2013 年，共新颁布实施了24 个中药注射剂指纹图谱标准，1 个注射用原料标准[1]。2015年版《中国药典》一部正文中明确增加了清开灵注射液和注射用双黄连（冻干）的HPLC特征图谱标准[2]。可见，增加指纹图谱标准是所有中药注射液质量标准提升中必不可少的内容。醒脑静注射液由麝香、冰片、郁金、栀子4味药经水蒸气蒸馏提取而制成，具有清热解毒，凉血活血，开窍醒脑之功，临床上广泛用于多种原因所致脑部疾病，如颅脑外伤、乙型脑炎、脑血管疾病等[3]。该品种现行标准是国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3B3353982003[4]，标准中仅规定醒脑静注射液中龙脑含量不得低于07 g·L-1，而未涉及指纹图谱的内容。有关醒脑静注射液质量标准研究的文献报道中，几乎全部是对麝香酮和/或龙脑的含量进行测定，检测方法包括气相色谱法（GC）[512]、气质联用法（GCMS）[13]和高效液相色谱法（HPLC） [14]，也未见任何关于其指纹图谱的研究报道。因此，为全面了解醒脑静注射液的化学成分信息并提升其质量控制水平，本研究首次采用HPLC法建立了醒脑静注射液的特征图谱并比较了3个厂家生产醒脑静注射液特征图谱的异同，以为今后该产品质量标准的提升奠定基础。

1材料

日本岛津LC20AT高效液相色谱仪（包括SIL20A自动进样器，CTO10AS 柱温箱和SPDM20A检测器），Labsolutions色谱工作站；1/10万电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司，瑞士）。

莪术二酮（批号E009110603）和吉马酮（批号111665201103）购自成都彼斯特生物科技有限公司。樟脑（批号Z018140801）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。优香芹酮（2，6，6三甲基2，4环庚烯1酮）、姜黄烯酮、莪术烯醇和莪术酮均由本实验室自制，经NMR和MS 确定结构。以上对照品经HPLC测定纯度>98%。甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher公司产品），水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

21批醒脑静注射液由无锡济民可信山禾药业股份有限公司提供，其他8批醒脑静注射液样品从市场购得。样品信息见表1。

2方法与结果

21色谱条件

采用Thermo BDS Hypersil C18 色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）002%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，40%A； 5～50 min，40%～60%A；50～60 min，60%～100%A；60～65 min，100%A；6501～75 min，40%A），流速10 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL。

22混合对照品溶液的制备

分别精密称取干燥至恒质量的优香芹酮、樟脑、莪术二酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术酮和莪术烯醇对照品适量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成一定浓度的混合对照品溶液。

23供试品溶液的制备

取醒脑静注射液3～5支，倾出内容物，混匀，精密吸取5 mL，通过C8固相萃取小柱（100 g·L-1），C8小柱先用无水乙醇浸泡，再用水20 mL预洗），流出液弃去，用1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液约08 mL，置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

24方法学考察

241稳定性试验精密吸取同一批号醒脑静注射液（120107）供试品溶液，按21项下色谱条件分别于制样后0，2，4，6，12，24 h进样分析，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3% （n=6），结果说明供试品的稳定性良好。

242精密度试验精密吸取同一批號醒脑静注射液（120107）供试品溶液，按照21项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），结果说明仪器的精密度良好。

243重复性试验取同一批号醒脑静注射液（120107）供试品溶液，各精密吸取6份，分别制备供试品溶液，进样检测，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），结果说明方法重复性良好。

25特征图谱的建立和主成分分析

251醒脑静注射液HPLC特征图谱的建立分别精密吸取29批醒脑静注射液供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，采集75 min 的HPLC图。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”进行数据分析处理，按照生产厂家的不同对无锡济民可信山禾药业生产醒脑静注射液（S1～S21）、大理药业股份有限公司生产醒脑静（S22～S24）和河南天地药业股份有限公司生产醒脑静（S25～S29）进行分别分析，见图1。①设定S1为参照图谱，将S2～S21与参照图谱进行自动匹配，生成无锡济民可信生产醒脑静注射液的HPLC特征图谱及21批醒脑静注射液HPLC对比图，计算得到S1～S21供试品与对照特征图谱的相似度分别为0972，0948，0978，0967，0982，0909，0970，0934，0936，0966，0982，0972，0969，0903，0943，0957，0959，0947，0951，0965，0963。各批醒脑静注射液与HPLC特征图谱之间的相似度均大于090，表明相似度良好。②设定S22为参照图谱，将S23～S24与参照图谱进行自动匹配，生成大理药业股份有限公司生产醒脑静注射液的HPLC特征图谱及3批醒脑静HPLC对比图，计算得到S22～S24供试品与对照特征图谱的相似度分别为0995，099，0999。大理药业股份有限公司的醒脑静注射液与HPLC特征图谱之间的相似度均大于099，表明相似度极好。③设定S25为参照图谱，将S26～S29与参照图谱进行自动匹配，生成河南天地药业股份有限公司生产醒脑静注射液的HPLC特征图谱及5批醒脑静HPLC对比图，计算得到S25～S29供试品与对照特征图谱的相似度分别为0968，092，074，0934，0979。这5批样品中的4批与对照图谱的相似度较好（相似度大于09），说明生产工艺基本稳定，但S27号样品（批号为140705）与对照图谱的相似度仅为074，推测可能是该批产品所用药材与其他批所用药材差别较大所致。

252特征峰的标定根据29批醒脑静的HPLC特征图谱检测结果，选择醒脑静中主要成分、单峰面积占总峰面积大于08%、出峰稳定且分离度良好的色谱峰作为特征峰，共标定了11个特征峰，见图1。经与对照品比对，4号峰为优香芹酮（1052 min），5号峰为樟脑（1507 min），6号峰为姜黄烯酮（1711 min），7号峰为莪术烯醇（1798 min），8号峰为莪术二酮（2470 min），9号峰为莪术酮（3092 min），11号峰为吉马酮（4579 min）。

253主成分分析采用主成分分析（PCA）方法对3组样品建模，以共有峰的峰面积为自变量（X）（以出峰时间标记峰的归属），以不同厂家生产的醒脑静注射液为因变量（Y）。设定Y为1/3的矩阵（无锡济民可信生产醒脑静设为1，大理药业股份有限公司设为2，河南天地药业股份有限公司设为3）。所有的数据导入到simcap软件进行聚类分析，利用其前3个主成分（PC1，PC2和PC3）进行画图区分，3个主成分对于方差的总贡献度为8769%。主成分分析的得分图见图2，无锡济民可信生产醒脑静注射液单独位于右侧，大理药业股份有限公司和河南天地药业股份有限公司生产的醒脑静注射液分别位于左上角和左下角，3者完全分类，说明本文建立的HPLC特征图谱能有效区分3个厂家生产的醒脑静注射液。主成分分析载荷图见图3，本研究所

A以S1醒脑静注射液样品为参照的共有模式；BS1～S21醒脑静注射液供试品特征模式；C以S22 醒脑静注射液样品为参照的共有模式；DS22～S24醒脑静注射液供试品特征模式；E以S25醒脑静注射液样品为参照的共有模式；FS25～S29 醒脑静注射液供试品特征模式；4优香芹酮；5樟脑；6姜黄烯酮；7莪术烯醇；8莪术二酮；9莪术酮；11吉马酮。

建立的特征变量（共有特征峰）对不同厂家的分类模型总体方差影响均较大（各指标离远点距离均较远），说明本研究选择的共有峰均具有明显的特征性，可作为不同厂家生产醒脑静注射液HPLC特征图谱的特征变量。

3讨论

31色谱条件的优化

实验中分别考察了3种色谱仪器（美国Waters e2695 高效液相色谱仪，美国HP1100高效液相色谱仪和日本岛津LC20AT高效液相色谱仪）和5种色谱柱（Thermo BDS Hypersil C18，TopsilTM C18 ，Dikma spursil C18，Waters xtcrra C18和Wonda Sil C18）对醒脑静注射液HPLC 特征图谱的影响，结果发现不同仪器对醒脑静注射液HPLC特征图谱影响不大，但色谱柱对其分离度有较大影响，其中Thermo BDS Hypersil C18（46 mm×250 mm，5 μm）和TopsilTM C18

2种色谱柱的分离效果最好，而其他3种色谱柱不能对各色谱峰进行有效分离，因此实验中应固定色谱柱为Thermo BDS Hypersil C18（46 mm×250 mm，5 μm）或TopsilTM C18（46 mm×250 mm，5 μm）。

实验中曾考察了不同比例甲醇水、乙腈水、甲醇甲酸水和乙腈甲酸水的洗脱效果，结果显示乙腈甲酸水梯度洗脱效果最好，最终优选流动相为乙腈002%甲酸水梯度洗脱。

32指纹图谱分析

麝香酮和龙脑是醒脑静注射液的主要成分和活性成分，因此，无论是醒脑静注射液现有标准还是围绕其开展的质量标准研究都是针对这2个成分进行定性定量分析，而对醒脑静注射液中含有的其他微量成分鲜有涉及。但是，郁金中含有大量的倍半萜类成分如莪术二酮、莪术酮、吉马酮、姜黄烯酮、莪术烯醇等，这些成分一样可经过水蒸气蒸馏而被提取出来，而且这些成分具有明确的抗炎、镇痛、抗血栓和改善血液循环等作用[1516]，这些作用与醒脑静注射液的功能主治完全吻合，因此它们应该是醒脑静注射液的活性成分。同样，栀子中也含有一定量的挥发性成分，如优香芹酮、异佛尔酮、反、反2，4癸二烯醛等，而栀子挥发油具有镇静、催眠、抗惊厥等作用，这些作用也与醒脑静注射液的功能主治相吻合，因此也应该是其活性成分[17]。当采用GC或GCMS方法进行研究时，由于麝香酮和龙脑的色谱峰过高，醒脑静中这些微量成分的信息几乎完全被掩盖掉。但是，由于紫外吸收很弱，麝香酮和龙脑在HPLCUV检测中则几乎看不到色谱峰。因此本研究首次采用HPLCUV建立了醒脑静注射液的特征图谱，有效显示了醒脑静中除麝香酮和龙脑之外其他微量成分的信息，进一步阐释了醒脑静注射液的药效物质基础。同时，利用对照品指认了其中7个主要色谱峰的结构，为提升其质量控制水平提供了依据。

醒脑静注射液共有3个厂家生产，分别对21批无锡济民可信山禾药业，3批大理药业股份有限公司，5批河南天地药业股份有限公司生产的醒脑静注射液进行了HPLC 特征图谱分析，结果发现3个厂家生产的醒脑静注射液化学成分的整体轮廓基本一致，而且同一厂家生产的不同批次的醒脑静注射液的相似度较高，但是不同厂家生产醒脑静注射液中主要色谱峰的含量及不同色谱峰之间的比例有很大的不同。例如无锡济民可信生产的醒脑静注射液中9号峰（莪术酮）很明显，相对峰面积均值为342 725，而其他厂家生产醒脑静的9号峰的相对峰面积均值仅为74 675，相差近5倍。又如21批济民可信和5批河南天地药业股份有限公司生产醒脑静注射液的HPLC图谱中2个主要色谱峰6号（姜黄烯酮）和7号峰（莪术烯醇）的相对峰面积均值之比为08左右，而大理药业股份有限公司生产的二者之比则为305。以上化学成分含量和成分間比例的变化是否会导致药效的改变值得深入探讨。

市场调研发现，市场流通的醒脑静注射液90%为无锡济民可信山禾药业生产，因此收集其他厂家的醒脑静注射液非常困难，本研究中仅仅收集到8批非济民可信生产的醒脑静注射液（大理药业股份有限公司的3个批次，河南天地药业股份有限公司的5个批次），样本量较少，还不足以全面评估其他厂家生产醒脑静样品的质量。今后研究中应积累多批样品进行分析测定，以进一步明确不同厂家生产醒脑静样品的异同，为合理制定该产品的质量标准提供依据。

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