技术的中药注射剂微毒快速测试体系反应条件的优化与方法学的考察

熊静悦 李孝容 鄢良春 赵军宁

[摘要]基于費氏弧菌CS234的Microtox微毒测试体系优化与方法学考察，为该方法更加可靠地应用于中药注射剂综合急性毒性的测试打下基础。采用PlackettBurman法优化设计影响费氏弧菌发光的因素，建立以七水硫酸锌为标准毒物和质量控制样品的反应体系，得到最优发光条件为：费氏弧菌冻干粉平衡15 min后加入复苏液1 mL，混匀10 min，取100 μL菌液测试初始发光度，随后立即加入1 mL复苏液或待测样品，反应10 min后再次测试相应发光强度，上述操作均在（15±1）℃条件下完成；复苏稀释液、渗透压调节液及七水硫酸锌储备液不干扰费氏弧菌发光强度的测定，该方法特异性良好；质量控制样品、定量下限样品批内精密度<5%，批间精密度<10%，准确度在858%～1032%。七水硫酸锌溶液在386～7727 mg·L-1，标准曲线方程为y=2178lnx-1514，R2=0998。该方法下ZnSO4·7H2O对费氏弧菌的IC50为1990 mg·L-1；对七水硫酸锌储备液及其质量控制样品分别连续考察120，8 h，其RSD<2%，提示其在室温及4 ℃保存条件下稳定性良好；pH 45～80时，费氏弧菌发光的波动控制在±10%，该pH可满足绝大多数中药注射剂的测试需要。针对费氏弧菌CS234建立的微毒测试体系进行优化后，具有良好的特异性、稳定性、灵敏度、准确度及适应性，提示可应用于中药注射剂综合急性毒性的测试。

[关键词]中药注射剂；微毒测试；急性毒性；费氏弧菌CS234

[Abstract]Vibrio fischeri CS234 was used to establish and optimize microtox assay system， laying a foundation for the application of this method in comprehensive acute toxicity test of traditional Chinese medicine （TCM） injections Firstly， the PlackettBurman method was carried out to optimize the factors which would affect Vibrio fischeri CS234 luminescence Secondly， ZnSO4·7H2O was chosen as reference substance to establish its reaction system with quality control samples The optimal luminescence conditions were achieved as follows： ①At a temperature of （15±1） ℃， Vibrio fischeri CS234 lyophilized powders were balanced for 15 min， then， 1 mL resuscitation fluid was added and blended for 10 min 100 μL bacteria suspension was taken to measure the initial luminescence intensity， and then 1 mL resuscitation fluid or test sample was immediately added；after reaction for 10 min， corresponding luminescence intensity was measured again Resuscitation diluent， osmotic pressure regulator and ZnSO4·7H2O stock solution showed no interference to the determination of Vibrio fischeri CS234 luminescence intensity， so this method was of good specificity The withinand betweenbatch precisions of quality controls and the lower limit of quantification （LLOQ） samples were <5% and <10% respectively， while the accuracy ranged between 858% and 1032% The standard curve equation of ZnSO4·7H2O ranged from 386 mg·L-1 to 7722 mg·L-1 （final concentrations） was y=2178lnx-1514， R2=0998； meanwhile， IC50 of ZnSO4·7H2O to Vibrio fischeri CS234 was 1990 mg·L-1 ZnSO4·7H2O stock solution and its quality controls were continuously investigated for 120 h and 8 h respectively， and their RSD was lower than 2%， indicating stability at room temperature and 4 ℃ storage conditions Between pH 4580， luminescence intensity of Vibrio fischeri CS234 was controlled within ±10%， and such pH value range could meet the testing needs of the vast majority of traditional Chinese medicine injections The Vibrio fischeri strain CS234 assay system was specific， stable， sensitive， accurate and adaptable after optimization， so it was suitable for the comprehensive acute toxicity assessment of TCM injections

[Key words]traditional Chinese medicine injection； microtox assay； acute toxicity； Vibrio fischeri CS234

doi：10.4268/cjcmm20160909

微毒测试技术是一种利用发光细菌进行的生物活体检测技术。20世纪70至80年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害、对环境敏感的发光细菌，用于抗生素、麻醉药物的筛选及水体生物毒性的检测等，现已成为一种简便、快速的生物急性毒性检测手段[1]。本课题组在国内外首次将微毒生物测试技术扩展到中药注射剂综合急性毒性的检测领域，试图解决现阶段仅对已知有效成分的测定远不能满足作为中药注射剂质量控制标准的问题[2]。本研究在前期工作基础上，对微毒测试体系方法学进行优化与验证，进一步提高该方法的应用范围与可靠性。

1材料

费氏弧菌Vibrio fischeri（Vf）CS234冻干粉试剂盒，编号D15G046，D15G037，D15G038，D15G039，D15G056，D15G033，北京滨松光子技术股份有限公司，-20 ℃避光冻存。

复苏稀释液（3%氯化钠溶液），批号20150717，北京滨松光子技术股份有限公司。渗透压调节液（20%氯化钠溶液），批号20150717，北京滨松光子技术股份有限公司。七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O），AR，批号2015030101，成都市科龙化工试剂厂。盐酸（HCl），AR，批号20131028，成都金山化学试剂有限公司。氢氧化钠（NaOH），AR，批号20110328，成都长联化工试剂有限公司。

LUMIStox 300型生物毒性测试仪、LUMIStherm型预温槽和测试管（Dr Bruno Lange GmbH公司）；ME203/02型电子天平[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]；KCL2000型恒温恒湿箱（东京理化器械株式会社）；Z2000型原子吸收分光光度计（日立公司）；锌空心阴极灯（北京有色金属研究院）；Integral 5型纯水仪（法国MilliQ公司）；PB10型酸度计（Sartorius公司）。

2方法

21反应条件的优化

采用PlackettBurman法将反应条件中的6个因子进行全面考察。选择 11因子2水平的实验设计，见表1，共进行12次实验，以 B，D，F，H，K 为空项估计试验误差，A，C，E，G，J，L 分别代表平衡时间、复苏液体积、复苏时间、菌液体积、样品体积和反应时间，每个因素取高低2水平，以各测试组方差P及发光系数的均值偏差D为判断标准选择最佳组合。使用到发光菌的所有操作均在（15±1） ℃条件下完成。

221特异性分别取复苏稀释液、渗透压调节液、ZnSO4·7H2O储备液和费氏弧菌CS234菌液各01 mL于485 nm处测试发光强度。

222线性范围、灵敏度、精密度及准确度精密称取ZnSO4·7H2O 500 mg置于500 mL量瓶中，超纯水充分溶解、定容，即得1000 mg·L-1储备液。取储备液用超纯水稀释，得质量浓度分别为50，200，400，800 mg·L-1系列溶液，再将各浓度标准毒物与渗透压调节液以17∶3混合，作为标准曲线的各点，按照21所优化的条件进行测试，ZnSO4·7H2O标准曲线各点的反应终浓度为386，1545，3091，6182，7727 mg·L-1。以公式（1）计算抑制率Ht和均值偏差D，并以HtZnSO4·7H2O浓度作图，拟合得到标准曲线方程及R2；灵敏度用定量下限即386 mg·L-1（终浓度）标准毒物的精密度和准确度表示。另取ZnSO4·7H2O储备液用超纯水配制150，500，900 mg·L-1溶液，再将各浓度标准毒物与渗透压调节液以17∶3混合，作为质量控制样品，反应终浓度为1159，3864，6955 mg·L-1，用以考察方法学的精密度（批间、批内）和准确度，精密度以RSD表示，准确度以测得值与实际值的百分比表示。

fkt=Ikt / I0（1）

D=（fkt±fkt）/fkt×100% （2）

Ict=Ic × fkt （3）

Ht=（Ict-It）/Ict×100%（4）

I0為对照管发光菌初始发光强度，Ikt为对照管发光菌与复苏稀释液接触一定时间后的发光强度，fkt为发光系数。D为发光系数的均值偏差，fkt为2个平行管fkt的平均值。Ict为样品管发光菌初始发光强度的校正值，Ic为样品管发光菌初始发光强度。It为样品管发光菌与样品接触一定时间后的发光强度，Ht为样品对发光强度的抑制率。

223稳定性取ZnSO4·7H2O储备液及150，500，900 mg·L-1质量控制样品进行Zn2+稳定性考察。由于原子吸收分光光度计测量Zn2+的线性范围在02～09 mg·L-1，故将储备液稀释到0538 mg·L-1（以Zn2+计）后考察0，2，4，6，8，24，48，72，120 h的稳定性，质量控制样品分别稀释到0137，0457，0822 mg·L-1考察0，2，4，6，8 h的稳定性，并以相应浓度的渗透压调节液作为对照，需过夜样品密封后置在4 ℃冰箱内保存。

224pH对费氏弧菌CS234的影响测试不同pH复苏液（40，45，50，60，70，80，90）对发光强度的影响。用1 mol·L-1 HCl溶液或NaOH溶液调节pH，加入样品中的体积不超过总体积的5%，每个pH设2个平行管，重复2次。由公式（3），（4）计算得到不同pH对费氏弧菌CS234发光强度的抑制率及其平均值。

23数据分析

Design Expert 805b软件进行PlackettBurman实验设计及数据分析。PEMS 31软件进行标准曲线的拟合及IC50的计算。

3结果

31反应条件优化

由于各测试组无统计学差异，则按照ISO 113483：2007的标准选择D<3%者为合格组合[3]，见表2。第3，4号实验组3次D均<3%，且以前者更优，故选定发光条件为费氏弧菌CS234冻干粉于恒温箱中平衡15 min，加入复苏液1 mL后混匀10 min，取100 μL菌液测试初始发光强度后立即加入1 mL复苏液（对照）或待测样品，反应10 min后再次测试对照管及样品管发光强度。

32特异性

复苏稀释液、渗透压调节液、ZnSO4·7H2O储备液的发光强度均在001～002，而费氏弧菌CS234菌液的发光强度在1 152～1 177，说明前三者不干扰费氏弧菌发光强度的测定，本方法特异性强，见表3。

33线性范围、灵敏度、精密度及准确度

定量下限样品及质量控制样品精密度均<10%，准确度在858%～1032%，见表4。ZnSO4·7H2O溶液在386～7727 mg·L-1，标准曲线方程为y=2178lnx-1514，R2=0998，本方法下ZnSO4·7H2O对费氏弧菌CS234的IC50为1990 mg·L-1。

34稳定性

ZnSO4·7H2O储备液及其质量控制样品分别连续考察120，8 h，其RSD均<2%，提示在室温及4 ℃保存条件下稳定性良好，见表5。

35pH对费氏弧菌CS234的影响

pH 45～80时，费氏弧菌CS234发光的波动<10%，见表6。表2PlackettBurman设计及结果（n=2）

目前常用的发光菌急性毒性测试方法主要有使用费氏弧菌NRRL B11177株的国际标准化组织ISO 113483： 2007《Water qualityDetermination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri（Luminescent bacteria test）Part 3： Method using freezedried bacteria》和使用明亮发光杆菌T3小种的中国国标GB/ T154411995《水质急性毒性的测定发光细菌法》[5]，由于国内尚无费氏弧菌的急性毒性测试方法，故其测试过程常参照后者。GB/T 154411995以相对发光强度的平均值（%），见公式（5），（6）及样品质量浓度（mg·L-1）拟合二元一次线性方程来表示样品的急性毒性，而本室前期研究显示费氏弧菌的发光强度随时间的延长呈下降趋势[6]，因此，这既不能消除发光菌自身发光强度的变化所产生的误差，也不能反映发光反应的核心——荧光素酶动力学的变化规律，故ISO标准中通过引入fkt，见公式（1），这一相对恒定的发光系数来校正该误差，就显得更为合理[7]。对于其他未严格规定的反应条件如平衡时间、混匀时间等，结合本试剂盒的实际情况，采用分辨度为Ⅲ级的PlackettBurman法设计了实验，并优化出最稳定的发光反应体系。

相对发光强度=标准毒物/样品管发光强度空白管发光强度（5）

相对发光强度平均值=重复1+重复2+重复33（6）

ISO标准规定：对照管与样品管的均值偏差D<3%、随行标准毒物与费氏弧菌反应30 min后的抑制率达到20%～80%即认为该测试批次合格。然而，D<3%仅能控制测试的精密度而不能保证测试结果的准确性，且样品反应时间少于30 min便无法适应该标准，因此，在ISO标准的基础上，建立了以ZnSO4·7H2O为标准毒物的质量控制系统，增加了ZnSO4·7H2O 3个浓度的质量控制样品对测试方法学开展了进一步的考察。ZnSO4·7H2O对人体及环境的损害远小于氯化汞、重铬酸钾及苯酚等现行标准毒物，且Zn2+对发光菌作用的靶点主要在于影响其荧光素酶系统及发光基因表达[89]，也为本课题进一步的深入提供了依据。

此外，还考察了pH对费氏弧菌发光的影响。注射剂应具有与血液相等或相近的pH，一般为pH 4～9，那么，明确该范围是否适合发光细菌正常的生理活动，将直接决定微毒生物测试体系的应用范围。结果显示，pH 45～80对细菌发光的抑制率在±10%内，可满足绝大多数中药注射剂的检测需要。

综上，本实验室通过对费氏弧菌反应条件的优化及方法学的考察，建立了适用于CS234这一菌株的测试体系，本方法具有良好的特异性、稳定性、灵敏度、准确度及适应性，为中药注射剂微毒急性毒性测试打下了坚实的基础。

[参考文献]

[1]朱文杰，郑天凌，李伟民. 发光细菌与环境毒性检测[M]. 北京： 中国轻工业出版社，2009.

[2]赵军宁，鄢良春. 基于Microtox（微毒测试）的中药综合毒性快速评价[J]. 世界中医药，2013，9（2）： 137.

[3]ISO113483： Water qualityDetermination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri （Luminescent bacteria test）Part 3： Method using freezedried bacteria[S]. 2007.

[4]周世明，舒為群，赵清. 发光菌在水环境污染物检测中的应用研究进展[J]. 环境与健康杂志，2007，24（10）： 837.

[5]GB/T 154411995，水质急性毒性的测定发光细菌法[S]. 1995.

[6]郑晓秋，鄢良春，赵军宁，等. 应用Microtox技术检测鱼腥草注射液综合毒性的研究[J]. 中药药理与临床，2013，29（6）： 92.

[7]马勇，黄燕，贾玉玲. 发光细菌急性毒性测试方法的优化研究[J]. 环境污染与防治，2010，32（11）： 48.

[8]王丽莎，魏东斌，胡洪营，等. 发光细菌毒性测试条件的优化与毒性参照物的应用[J]. 环境科学研究，2004，17（4）：61.

[9]Ali B Ishaque，Linda Johnson，Tonya Gerald，et al. Assessment of individual and combined toxicities of four nonessential metals （As，Cd，Hg and Pb） in the microtox assay [J]. Int J Environ Res Public Health，2006，3（1）： 118. [责任编辑孔晶晶]