响应面法优化猪毛菜总黄酮提取工艺

公衍玲，王沙沙，刘　洋

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)



响应面法优化猪毛菜总黄酮提取工艺

公衍玲，王沙沙，刘洋

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)

摘要：采用乙醇回流法提取猪毛菜总黄酮，通过单因素实验和星点设计-响应面法实验优化猪毛菜总黄酮提取工艺。以浸泡时间、液料比、乙醇浓度、回流温度、回流时间为考察因素，以总黄酮得率为评价指标，采用分光光度法测定吸光度，通过单因素实验筛选乙醇回流法的主要影响因素；再通过星点设计-响应面法实验进一步优化提取工艺条件。结果表明，乙醇回流法提取猪毛菜总黄酮的最优条件为：浸泡时间30 min、液料比21∶1(mL∶g)、乙醇浓度62%、回流温度100 ℃、回流时间109 min，该条件下猪毛菜总黄酮得率预测值为0.8405%，实测平均值为0.8387%，平均偏差为0.65%，RSD为0.47%。该方法模型预测性良好、偏差较小、提取条件稳定、可靠性高。

关键词：猪毛菜；总黄酮；响应面法；提取

猪毛菜(Salsola collinaPall.)又名蓬蓬菜，是藜科猪毛菜属植物，为一年生肉质草本植物，广泛分布于东北、华北、陕西、甘肃等地，生命力强，资源丰富[1]。研究发现，猪毛菜的主要成分包括黄酮、甾醇、生物碱、有机酸等[2-4]，药理实验证实猪毛菜具有明确的降压和抑制中枢等作用[5-7]，生物碱可能是其降压的物质基础之一[8-10]，猪毛菜硒含量高，有防癌、抗癌作用[11-13]，能增强人体免疫力，强身健体，减少疾病[14]。若能在其化学、药理、制剂等方面进行深入研究，将对充分开发和利用猪毛菜资源、提高经济效益具有重大意义。

作者采用传统乙醇回流法提取猪毛菜中的总黄酮[15-19]，以总黄酮得率为评价指标，通过单因素实验筛选醇提工艺的主要影响因素，再通过星点设计-响应面法实验优化醇提工艺。综合考虑总黄酮得率、提取成本、提取时间、操作复杂程度等因素，确定最佳提取工艺，拟为猪毛菜的综合利用提供参考。

1实验

1.1材料、试剂与仪器

猪毛菜，青岛众生大药房。

芦丁标准品，成都曼思特生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

UV-3000型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，常州华普达教学仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；KDM型调温加热套，龙口电炉制造厂；高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；YP601N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2方法

1.2.1芦丁标准曲线的绘制

精密称取5 mg 120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品，置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶解，摇匀，定容，得浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。分别精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL芦丁标准溶液置于25 mL容量瓶中，精密加入1 mL 5%的NaNO2溶液，混匀，室温放置6 min；然后精密加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，室温放置6 min；再精密加入10% NaOH溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min；测定510 nm处吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制芦丁标准曲线。

1.2.2猪毛菜总黄酮的提取

精确称取10.0 g猪毛菜，切块捣碎成粗浆，装入蒸馏瓶中。加入乙醇溶液后，充分振荡，再放入水浴锅中充分冷凝回流提取，得粗提液。待粗提液冷却后，利用真空抽滤机减压抽滤。滤液旋转蒸发挥去乙醇得浓缩液，稀释后作为待测液。

1.2.3猪毛菜总黄酮得率的测定

精密量取猪毛菜总黄酮待测液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入1 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，室温放置6 min，然后精密加入1 mL 10%Al(NO3)3溶液，摇匀，室温放置6 min，最后精密加入10% NaOH溶液10 mL，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以50% 乙醇为空白对照，用分光光度计测定510 nm处吸光度，按下式计算总黄酮得率：

1.2.4单因素实验

1.2.4.1浸泡时间的选择

确定液料比10∶1(mL∶g，下同)、乙醇浓度50%、回流温度60 ℃、回流时间60 min，分别浸泡30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察浸泡时间对总黄酮得率的影响。

1.2.4.2液料比的选择

确定浸泡时间30 min、乙醇浓度50%、回流温度60 ℃、回流时间60 min，在液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1时提取，考察液料比对总黄酮得率的影响。

1.2.4.3乙醇浓度的选择

确定液料比10∶1、浸泡时间30 min、回流温度60 ℃、回流时间60 min，在乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%时提取，考察乙醇浓度对总黄酮得率的影响。

1.2.4.4回流温度的选择

确定液料比10∶1、浸泡时间30 min、乙醇浓度50%、回流时间60 min，在回流温度分别为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃时提取，考察回流温度对总黄酮得率的影响。

1.2.4.5回流时间的选择

确定液料比10∶1、浸泡时间30 min、乙醇浓度50%、回流温度60 ℃，分别回流30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察回流时间对总黄酮得率的影响。

1.2.5星点设计-响应面法实验

在单因素实验的基础上，以总黄酮得率为响应值，固定浸泡时间与回流温度，选择液料比、乙醇浓度、回流时间为3因素，进行星点设计-响应面法实验以进一步优化醇提工艺。星点设计-响应面法实验的因素与水平见表1。

表1星点设计-响应面法实验的因素与水平

2结果与讨论

2.1单因素实验结果与分析

2.1.1浸泡时间对总黄酮得率的影响(图1)

由图1可知，随着浸泡时间的延长，总黄酮得率呈先降低后升高的趋势。原因可能是，浸泡时间为30～90 min时，总黄酮提取不完全，但杂质浸出量相对于总黄酮浸出量要多，整体表现为总黄酮得率降低；随着浸泡时间的进一步延长，总黄酮的浸出增加量高于杂质的浸出增加量，整体表现为总黄酮得率明显升高。综合考虑，选择浸泡时间30 min作为星点设计-响应面法实验的中心条件。

2.1.2液料比对总黄酮得率的影响(图2)

由图2可知，总黄酮得率随液料比的增大先升高后降低，在液料比为20∶1时，总黄酮得率最高；继续增大液料比，总黄酮得率反而下降。可能是因为，液料比增大，系统稀释度升高导致总黄酮溶出加快，随着提取剂用量的增加，提取剂体系与物料体系间有效成分的浓度差随之增大，物料内部有效成分的残余减少，从而提高了总黄酮得率；当液料比超过20∶1时，总黄酮溶出不够充分，且溶剂用量过多，成本增加。综合考虑，选择液料比20∶1作为星点设计-响应面法实验的中心条件。

2.1.3乙醇浓度对总黄酮得率的影响(图3)

由图3可知，总黄酮得率随乙醇浓度的升高先升高后降低，在乙醇浓度为60%时，总黄酮得率达到最高。原因可能是，总黄酮在乙醇中的溶解度以及物料在乙醇中的渗透性都随乙醇浓度的升高而提高，致使总黄酮得率升高；但随着乙醇浓度的继续升高，提取过程中所需的溶剂增多，成本增加。综合考虑，选择乙醇浓度60%作为星点设计-响应面法实验的中心条件。

2.1.4回流温度对总黄酮得率的影响(图4)

由图4可知，回流温度越高，总黄酮得率越高。这可能是由于，回流温度升高，总黄酮在乙醇中的溶解度增大，同时扩散系数增大，浸提液黏度减小，提取速度也随之加快；但回流温度过高会破坏提取液中的活性成分，消耗大量热能，且溶出的杂质量增加，给后续操作带来不便，增加成本。综合考虑，选择回流温度100 ℃作为星点设计-响应面法实验的中心条件。

2.1.5回流时间对总黄酮得率的影响(图5)

由图5可知，随着回流时间的延长，总黄酮得率先升高后降低，在回流时间为60 min时，总黄酮得率达到最高；在回流时间超过90 min后，总黄酮得率趋于稳定。原因可能是，回流60 min后，猪毛菜中总黄酮已基本溶出，所以总黄酮得率不再随回流时间的延长而继续升高；另外随着回流时间的延长，将出现蛋白质及杂质沉淀，影响总黄酮的溶出，且回流液中的有效成分也被破坏，导致总黄酮分解，且回流时间过长，将导致部分乙醇溶剂挥发，从而影响提取效果。综合考虑，选择回流时间90 min作为星点设计-响应面法实验的中心条件。

2.2星点设计-响应面法实验结果与分析

2.2.1星点设计实验结果(表2)

使用Design-Expert软件分析实验结果，得回归方程为：总黄酮得率=-6.09452+0.068749A+0.20028B-4.58031×10-4C-2.33345×10-4AB+1.23744×10-4AC+5.06760×10-5BC-1.61307×10-3A2-1.61307×10-3B2-2.41131×10-5C2。方差分析结果见表3。

从表3可知，以总黄酮得率为响应值时，模型P=0.0004<0.0500。一次项中的影响程度为乙醇浓度>回流时间>液料比。各因素中一次项、二次项影响较为显著，再次说明各实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，乙醇浓度和液料比、乙醇浓度和回流时间的相互作用不显著。综上可知，二次方程的R值与线性方程相比有了很大的提高，P<0.01，表明二次方程显著性较高，删除不显著项可得简化方程：总黄酮得率=-6.09452+0.20028B-4.58031×10-4C+1.23744×10-4AC-1.61307×10-3A2-1.61307×10-3B2-2.41131×10-5C2。

2.2.2响应面分析及工艺优化

采用Design-Expert 软件进行多元回归拟合分析，得2个自变量的三维响应面图，如图6所示。

表2星点设计实验结果

表3方差分析结果

由图6可知，液料比在(18～23)∶1范围内、乙醇浓度在55%～65%范围内、回流时间在80～115 min范围内有较高的总黄酮得率。经分析得到回归模型的最大值点，即液料比21.01∶1、乙醇浓度62.29%、回流时间109.87 min，在此条件下，总黄酮得率为0.8405%。因此，结合生产实际，确定液料比21∶1、乙醇浓度62%、回流时间109 min、回流温度100 ℃、浸泡时间30 min为乙醇回流法提取猪毛菜总黄酮的最优工艺。

2.2.3验证实验

在液料比为21∶1、乙醇浓度为62%、回流时间为109 min、回流温度为100 ℃、浸泡时间为30 min的条件下，采用乙醇回流法提取猪毛菜中的总黄酮，重复实验3次，结果如表4所示。

表4验证实验结果/%

由表4可知，预测值与实测值相比较，平均偏差率为0.65%、RSD为0.47%，偏差较小。可见，由数学模型所得到的优化条件符合设计目标，数学模型和实验设计具有重现性和可靠性。

3结论

通过单因素实验分别考察了浸泡时间、液料比、乙醇浓度、回流温度、回流时间等5个因素对猪毛菜总黄酮得率的影响，再选取其中3个对总黄酮得率影响较为显著的因素，即液料比、乙醇浓度、回流时间，进行星点设计-响应面法实验优化提取工艺，确定猪毛菜总黄酮的最佳提取工艺条件为：浸泡时间30 min、液料比21∶1(mL∶g)、乙醇浓度62%、回流温度100 ℃、回流时间109 min，在此条件下，总黄酮得率为0.8405%。在上述最佳条件下，进行3次验证实验，总黄酮得率实测值与预测值接近。可见，由星点设计-响应面法实验所得到的优化条件与设计目标相符，数学模型和实验设计具有重现性和可靠性。

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Optimization of Extraction Process for Total FlavonoidsfromSalsolaCollinaPall. by Response Surface Methodology

GONG Yan-ling,WANG Sha-sha,LIU Yang

(CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266042,China)

Keywords：Salsola collinaPall.;totalflavonoids;responsesurfacemethodology;extraction

Abstract：ThetotalflavonoidsfromSalsola collinaPall.wereextractedbyanethanolrefluxingmethod,andtheoptimumextractionconditionswereoptimizedbyasinglefactorexperimentandacentralcompositedesign-responsesurfacemethodology(CCD-RSM).Usingsoakingtime,liquid-solidratio,ethanolconcentration,refluxingtemperatureandrefluxingtimeasfactors,andtheyieldoftotalflavonoidsasanevaluationindex,throughdeterminingtheabsorbancebyspectrophotometry,themaininfluencingfactorsofethanolrefluxingmethodwerescreenedbyasinglefactorexperiment.ThentheoptimumextractionconditionswereobtainedbyCCD-RSMasfollows:soakingtimeof30min,liquid-solidratioof21∶1(mL∶g),ethanolconcentrationof62%,refluxingtemperatureof100 ℃,refluxingtimeof109min.Underaboveconditions,theyieldoftotalflavonoidswaspredictedtobe0.8405%,themeasuredaveragevaluewas0.8387%,theaveragedeviationwas0.65%andRSDwas0.47%.Thismethodhasgoodpredictiveabilitywithsmalldeviationandhighreliability,andtheoptimizedextractionconditionswerestable.

基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(81300281)，山东省高校科技计划项目(J15LK12)

收稿日期：2016-01-28

作者简介：公衍玲(1975-)，女，山东临沂人，博士，副教授，研究方向：药物活性筛选与评价，E-mail：hanyu_ma@126.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.005

中图分类号：R 284.2

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)06-0025-05