海州香薷离体再生技术研究

康　薇，刘远河

(矿区环境污染控制与修复湖北省重点实验室，湖北 黄石 435003)



海州香薷离体再生技术研究

康薇，刘远河

(矿区环境污染控制与修复湖北省重点实验室，湖北 黄石 435003)

摘要：为探讨适合海州香薷的组培育苗技术，解决生产实践中海州香薷种苗供应不足的问题，选择大冶铜绿山矿区生长的野生海州香薷为试材，通过外植体选择、激素配比优化、愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养等步骤，建立了海州香薷的离体再生体系。结果表明，以海州香薷带芽节段为外植体，愈伤组织诱导的最适培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4，愈伤组织分化不定芽的最适培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4，在此条件下，愈伤组织诱导率最高可达98.3%，不定芽分化率最高可达100%，单个愈伤组织不定芽分化数平均达7.5个。将不定芽置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4上很容易生根，生根组培苗在装有铜污染土壤的培养盆中成活率可达100%。

关键词：海州香薷；组培育苗；植物修复；铜污染土壤

海州香薷(Elsholtzia haichouensisSun)，俗称铜草花、铜草，为唇形科、香薷属一年生草本植物。海州香薷既是一种药用价值较高的中药材，又是一种理想的铜污染土壤修复植物。海州香薷富含具有广谱抗菌活性的香薷酮，可用于防治流行性感冒[1-2]；海州香薷还是一种铜指示植物，具有极高的铜富集特性，且主要分布在铜含量较高的铜矿区或铜矿废弃地。因此，近年来，作为一种铜污染土壤的植物修复材料，海州香薷备受关注[3-4]。

自然条件下，海州香薷以种子繁殖，由于花期较短且集中在秋季，加之采种难度较大，因而不能满足大规模生产用种需求。目前，通过组织培养已经成功实现了石香薷(Mosla chinensisMaxim)[5]和香薷(Elshoitzia ciliatHyland)[6]的离体再生，但鲜见海州香薷组培育苗的报道。鉴于此，作者以湖北大冶铜绿山古铜矿遗址上生长的海州香薷为试材，通过外植体选择、愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养等步骤，筛选合适的培养条件，建立海州香薷的离体再生体系，拟为大规模繁殖海州香薷组培苗奠定基础。

1实验

1.1材料

海州香薷植株，采自大冶铜绿山古铜矿遗址内遗存的古冶炼渣上。

1.2方法

1.2.1基本培养基的选择

海州香薷作为一种铜指示植物，具有嗜铜特性，需要铜浓度较高的生长环境。野外调查发现，大冶铜绿山古铜矿遗址上古冶炼渣的铜含量为420.32～14 644.63mg·kg-1，平均值高达3 166.73mg·kg-1[7]。因此，直接用MS培养基作为海州香薷组织培养的基本培养基不能满足外植体增殖和生长的需要。综合野外调查和预培养实验结果，本实验选择CuSO4含量为3.2mg·L-1的MS培养基为海州香薷组织培养的基本培养基。

1.2.2外植体的制备

为了降低启动培养时的染菌率，本实验采用野外采集植株室内盆栽的途径培养海州香薷获取外植体。具体做法是：5月中下旬，连同生长地土壤挖取海州香薷植株进行室内装盆，用剪刀沿盆土处去除植株上部，将盆置于组培室内培养至长出新芽后，从植株中间切取长约10～15cm的带芽节段，用自来水冲洗30～40min后，转入超净工作台切取叶片，先用70%酒精将叶片消毒15～20s，再用0.1%升汞处理5～7min，最后用无菌水冲洗4～5次后晾干。

1.2.3离体再生技术研究

分别以带芽节段、不带芽节段和叶片作为诱导愈伤组织的外植体，在培养温度为(25±2) ℃、光照强度为3 000lx、光照时间为16h·d-1的条件下培养一定时间，进行愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养实验，研究海州香薷的离体再生技术。实验均设3次重复。

1)愈伤组织诱导

将3种外植体分别接种在MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+25g·L-1蔗糖+6.5g·L-1琼脂+3.2mg·L-1CuSO4上，培养15d后观察外植体的愈伤组织诱导效果。按式(1)计算愈伤组织诱导率，确定最佳外植体。

(1)

将最佳外植体接种在不同激素配比(6-BA和NAA的配比，下同)的培养基上，培养15 d后观察愈伤组织的诱导效果。按式(1)计算愈伤组织诱导率，确定愈伤组织诱导的最适培养基。

2)不定芽分化

将最佳外植体接种在不同激素配比的培养基上，培养15 d后观察愈伤组织分化不定芽的情况。按式(2)计算不定芽分化率，确定愈伤组织分化不定芽的最适培养基。

(2)

3)生根培养

选择长约2～3 cm健壮不定芽切下后，置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4上生根培养10～15 d，待不定芽长出3～5条鸡爪根后，于25 ℃左右开瓶炼苗1周，将生根苗转入装有铜污染土壤的培养盆中栽植，观察成活情况。

2结果与讨论

2.1不同外植体的愈伤组织诱导效果(表1)

表1海州香薷不同外植体的愈伤组织诱导效果

由表1可知，不同外植体生长情况差异较大。带芽节段外植体呈鲜绿色，节段下端切口处有愈伤组织长出，呈膨大状，愈伤组织诱导率达96.7%；不带芽节段外植体呈黄褐色，为坏死状，没有愈伤组织形成；叶片外植体呈绿色，叶蜷缩、且被绿色颗粒状的愈伤组织附着，愈伤组织诱导率仅53.3%。表明，海州香薷诱导愈伤组织，选用带芽节段为外植体效果较好。

2.2激素配比对愈伤组织诱导效果的影响(表2)

表2激素配比对海州香薷愈伤组织诱导效果的影响

注：基本培养基为MS+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4。

由表2可知，愈伤组织诱导率最高的是5#处理组，高达98.3%；其次是6#处理组和4#处理组，分别为86.7%和78.3%；其它处理组的愈伤组织诱导率都在60%以下。因此，用海州香薷带芽节段诱导愈伤组织时，选择0.5 mg·L-16-BA 与0.5 mg·L-1NAA 配比较为适合，即用MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4为培养基较为合适。

2.3激素配比对愈伤组织分化不定芽的影响(表3)

表3激素配比对海州香薷愈伤组织分化不定芽的影响

Tab.3Effect of the ratio of plant hormone on adventitions

注：基本培养基为MS+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4；接种愈伤组织数为45个。

由表3可知， 9个处理组的愈伤组织均分化不定芽，但不定芽分化率和分化不定芽愈伤组织数差别较大，其中5#、4#和6#处理组的不定芽分化率都在90%以上，分别为100%、95.6%和91.1%，单个愈伤组织平均分化不定芽数依次为7.5个、5.5个和5.5个。从不定芽长势看，5#处理组分化的不定芽更健壮、饱满(图1b)。综合考虑，用0.5 mg·L-16-BA与0.1 mg·L-1NAA配比较为合适，愈伤组织分化不定芽的效果更好，即选择MS+0.5mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4更为合适。

2.4生根和移栽

将健壮不定芽置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4上生根培养10～15 d，然后移栽在装有铜污染土壤的培养盆中，成活率达100%。海州香薷离体再生过程如图1所示。

a.MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4诱导的愈伤组织b.愈伤组织在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4上分化的不定芽c.健壮不定芽组培苗d.移栽

图1海州香薷离体再生过程

Fig.1 Regeneration process ofElsholtziahaichouensisSuninvitro

3结论

通过外植体选择、激素配比优化、愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养等步骤，建立了海州香薷的离体再生体系，以带芽节段为外植体，以6-BA和NAA为外源激素，海州香薷愈伤组织诱导的最适培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4，愈伤组织分化不定芽的最适培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4。在此条件下，愈伤组织诱导率最高可达98.3%，不定芽分化率最高可达100%，单个愈伤组织平均分化不定芽数可达7.5个。将不定芽置于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂+3.2 mg·L-1CuSO4上很容易生根，炼苗后的生根苗在盛有铜污染土壤的培养盆中成活率可达100%。

参考文献：

[1]孙慧锋,朱顺达.氮素形态对海州香薷(Elsholtziasplendens)铜吸收和积累的影响[J].中国农学通报,2010(5):272-275.

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[3]李保印,周秀梅,郝峰鸽,等.我国香薷属植物研究进展[J].河南科技学院学报(自然科学版),2012,40(1):37-40,44.

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[8]杜荣骞.生物统计学[M].第二版.北京:高等教育出版社,2003:241.

Regeneration Technology ofElsholtziaHaichouensisSuninvitro

KANG Wei,LIU Yuan-he

(HubeiKeyLaboratoryofMineEnvironmentalPollutionControl&Remediation,Huangshi435003,China)

Keywords：Elsholtzia haichouensisSun;tissecultureandseedinggrowth;phytoremediation;coppercontaminatedsoil

Abstract：InordertomakeupfortheshortageofproductionpracticeinElsholtzia haichouensisSunseeding,tissueculturaltechniquehasbeenstudied.Inthepaper,wechoosetheexperimentalmaterialofElsholtzia haichouensisSunwhichgrowsinDayeTongluMountain,Hubei,China,andestablishitsregenerationsystemin vitrobychoosingexplants,regulatingtheratioofplanthormone,inducingthecallus,differentiatingtheadventitiousbudandrootingculture.Theresultsshowthatusingbudsegmentsasexplants,thebestmediumofcallusinductionandthebuddifferentiationareasfollows:MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+sucrose25g·L-1+agar6.5g·L-1+CuSO43.2mg·L-1,MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+sucrose30g·L-1+agar7.0g·L-1+CuSO43.2mg·L-1,respectively.Underaboveconditions,callusinductionrateandadventitiousbuddifferentiationratereachupto98.3%and100%,respectively.Theaveragequantityofbudsproducingfromthesignalcallusis7.5.ThemediumcomponentofMS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+sucrose30g·L-1+agar7.0g·L-1+CuSO43.2mg·L-1isbeneficialtobuds′rooting.Thesurvivalrateofrootingbudscouldreach100%incultivatingbasinwiththecoppercontaminatedsoils.

基金项目：湖北省科技厅公益性科技研究项目(2012DCA23001)，湖北省高等学校科技创新团队项目(T201317)

收稿日期：2016-02-02

作者简介：康薇(1983-)，女，湖北荆门人，博士，讲师，研究方向：污染环境生物修复；通讯作者：刘远河，高级工程师，E-mail：1241854033@qq.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.012

中图分类号：Q 813.1X 173

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)06-0056-03