尿素包合法富集鱼油乙酯中的EPA和DHA

单幸福，李　江，郑晓林，许　媛，刘发义

(1.青岛澳海生物有限公司，山东 青岛 266101；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛 266061；3.日照职业技术学院，山东 日照 276826)



尿素包合法富集鱼油乙酯中的EPA和DHA

单幸福1，李江2，郑晓林3，许媛1，刘发义1

(1.青岛澳海生物有限公司，山东 青岛 266101；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛 266061；3.日照职业技术学院，山东 日照 276826)

摘要：采用尿素包合法富集鱼油乙酯中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，通过单因素实验和正交实验确定最优富集工艺为：m(尿素)∶m(鱼油乙酯)为1.5∶1、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)为3∶1、包合时间1 h、包合温度75 ℃、结晶温度25 ℃，一次包合的EPA+DHA含量可达85%以上，收率60%。

关键词：鱼油乙酯；EPA；DHA；尿素包合法

二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)同属ω-3型多烯脂肪酸(ω-3PUFAs)，是人类不能自身合成的必需脂肪酸[1]。医学和营养学研究表明，EPA和DHA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、舒张血管、调节血脂、升高HDL(高密度脂蛋白胆固醇)、降低LDL(低密度脂蛋白胆固醇)等功能，对心脑血管疾病、糖尿病、炎症、肾病以及癌症也有较好的疗效[2-3]，因此，以EPA和DHA为主要成分的保健品销量大增，但绝大多数产品中EPA含量在18%左右、DHA含量在12%左右，有些甚至更低，仅有少量产品中的EPA+DHA含量能达到50%。闵征桥等[4]采用尿素包合工艺将EPA+DHA含量提高到72%。2010年我国药典[5]公布的药品级多烯酸乙酯的EPA+DHA含量高达84%以上(达到欧洲相关标准)。而目前国内EPA+DHA含量高于84%的产品并不多，生产工艺也比较复杂。因此，高含量EPA+DHA产品的制备技术仍是国内外研究的热点。

EPA和DHA主要来自于海洋鱼类，从一般食物中难以摄取。目前，从鱼油中富集纯化EPA和DHA的方法主要有有机溶剂法、低温溶剂结晶法、硝酸银配合法、超临界CO2萃取法、色谱分离法、脂肪酶催化法、分子蒸馏法和尿素包合法[6-7]等。其中，尿素包合法因设备简单、试剂便宜、操作简便、无需高温、能够比较完全地保留PUFAs的营养和生理活性而成为近年来富集PUFAs的重要手段[8]。作者在前期研究的基础上，以EPA+DHA含量较高的鱼油脂肪酸乙酯(以下简称鱼油乙酯)为原料，通过单因素实验和正交实验对尿素包合法进行优化。

1实验

1.1原料、试剂与仪器

鱼油乙酯，购自江苏无锡迅达海洋生物制品有限公司。其中一种EPA+DHA含量为70.3%，EPA和DHA含量分别为15.4%和54.9%；另一种EPA+DHA含量为75%，EPA和DHA含量分别为54%和21%。

尿素，山东鲁西化工有限公司；95%乙醇，莱阳康德化工有限公司；盐酸、正己烷均为分析纯。

DK-8D型数显恒温水浴锅；EYELA(OSB-2100)型旋转蒸发仪；SHZ-(Ⅲ)D型水循环真空泵；Agilent7890B型气相色谱仪。

1.2尿素包合法富集鱼油乙酯中的EPA和DHA

向装有乙醇的三颈烧瓶中加入一定量尿素，置于75 ℃恒温水浴，搅拌，得到尿素和乙醇的饱和溶液。称取一定量鱼油乙酯，加入到尿素和乙醇的饱和溶液中，于75 ℃搅拌1 h后，自然冷却至室温(约25 ℃)，静置过夜，过滤除去结晶的尿素，用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇，然后用盐酸溶液溶解剩余物，即得DHA和EPA的富集产物。

1.3富集工艺优化

分别在m(尿素)∶m(鱼油乙酯)(g∶g，下同)为1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1，V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)(mL∶g，下同)为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的条件下，考察m(尿素)∶m(鱼油乙酯)、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)对富集效果的影响。在此基础上，分别以EPA+DHA含量和收率为考核指标，以m(尿素)∶m(鱼油乙酯)、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)、包合时间为考察因素，进行L9(34)正交实验，以确定最佳的富集工艺。

1.4EPA和DHA的含量测定

参照GB/T 17377-2008，采用气相色谱，用面积归一化法测定产物中EPA和DHA的含量。色谱条件：色谱柱为Rtx-1(30 m×0.5 mm)；氢火焰离子检测器；分流比20∶1；固定升温程序；气化温度250 ℃；检测器温度260 ℃；柱温200 ℃；载气压力200 kPa；氢气流速30 mL·min-1；空气流速300 mL·min-1；进样量0.2 μL。

2结果与讨论

2.1气相色谱分析

采用尿素包合法富集鱼油乙酯中的EPA和DHA，鱼油乙酯在富集前后的气相色谱如图1所示。

由图1可以看出，EPA和DHA的出峰时间分别为28 min和54 min；富集后的鱼油乙酯中的饱和脂肪酸成分较富集前明显减少。

2.2单因素实验

2.2.1m(尿素)∶m(鱼油乙酯)对富集效果的影响(表1)

由表1可知，随着尿素用量的增加，鱼油乙酯中EPA+DHA含量总体呈上升趋势。当m(尿素)∶m(鱼油乙酯)为1.0∶1时，EPA+DHA含量仅为80.7%；而当m(尿素)∶m(鱼油乙酯)在(1.5～3.0)∶1范围内时，EPA+DHA含量均可达到85%以上，彼此间并没有显著差异，但液相收率会随着尿素用量的增加有所降低。这可能是因为，当尿素用量较少时，尿素分子对饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的包合率较低；随着尿素用量的增加，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸与尿素形成包合物的效率大幅升高，EPA+DHA的含量相应升高；当尿素用量增加到一定程度后，被包合的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸已经达到平衡，如果继续增加尿素用量，尿素反而会与不饱和脂肪酸发生包合，虽然EPA+DHA的含量可能会进一步升高，但升幅甚微，而且会影响液相收率。因此，m(尿素)∶m(鱼油乙酯)以1.5∶1较合适。

表1m(尿素)∶m(鱼油乙酯)对富集效果的影响

富集条件：鱼油乙酯10 g，95%乙醇60 mL，V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)=6∶1，包合温度75 ℃。富集前鱼油乙酯中的EPA含量为15.4%，DHA含量为54.9%，EPA+DHA含量为70.3%。

2.2.2V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)对富集效果的影响(表2)

表2V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)对富集效果的影响

富集条件：鱼油乙酯10 g，尿素15 g，m(尿素)∶m(鱼油乙酯)=1.5∶1，包合温度75 ℃。

由表2可知，V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)对EPA+DHA含量影响不大；随着乙醇用量的增加，液相收率显著升高，但当V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)超过3∶1时，液相收率升幅趋缓。这可能是因为，随着乙醇用量的增加，虽然溶解在乙醇中的多烯脂肪酸乙酯含量相应升高，但过滤会影响对多烯脂肪酸的吸附及包合，因而液相收率并没有出现明显的变化。因此，V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)以3∶1较合适。

2.3正交实验

在单因素实验的基础上，以EPA+DHA含量和收率为考核指标，以m(尿素)∶m(鱼油乙酯)(A)、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)(B)、包合时间(C)为考察因素，进行L9(34)正交实验，结果与分析见表3。

由表3可知，各因素对EPA+DHA含量的影响大小依次为B>A>C，最优条件为A3B3C2，即m(尿素)∶m(鱼油乙酯)为1.5∶1、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)为3∶1、包合时间为1 h；各因素对收率的影响大小依次为A>B>C，最优条件为A1B3C3，即m(尿素)∶m(鱼油乙酯)为0.5∶1、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)为3∶1、包合时间为2 h。考虑到本实验的主要目的是使EPA+DHA含量达到84%以上，因此，确定最优富集工艺为：m(尿素)∶m(鱼油乙酯)1.5∶1、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)3∶1、包合时间1 h，此时，EPA+DHA含量为85.2%，回收率为60%。

2.4讨论

以三甘酯型鱼油(EPA+DHA含量低)为原料采用尿素包合法富集EPA和DHA的常规方法是：先对鱼油进行乙酯化，再用尿素包合浓缩。通常需要使用3倍以上的尿素、6倍或更多的乙醇，一次包合的EPA+DHA含量只有70%，远达不到国家药典要求(>84%)。本实验以鱼油乙酯为原料(EPA+DHA含量75%)，只需使用1.5倍的尿素、3倍的乙醇，一次包合，室温(25 ℃)冷却结晶，即可将鱼油乙酯中EPA+DHA含量提高到85%以上，达到国家药典要求。与常规方法相比，具有成本低、节能、废物和废水少、操作简便易行、便于大规模工业化生产等优点。

表3正交实验结果与分析

3结论

采用尿素包合法富集鱼油乙酯中的EPA和DHA，通过单因素实验和正交实验确定最优富集工艺为：m(尿素)∶m(鱼油乙酯)为1.5∶1、V(乙醇)∶m(鱼油乙酯)为3∶1、包合时间1 h、包合温度75 ℃、结晶温度25 ℃，一次包合的EPA+DHA含量可达85%以上，收率60%。该方法具有成本低、节能、废物和废水少、操作简便易行、便于大规模工业化生产等优点。

参考文献：

[1]肖玫，欧志强.深海鱼油中两种脂肪酸(EPA和DHA)的生理功效及机理的研究进展[J].食品科学，2005，26(8)：522-526.

[2]雷启俊.尿素包合法提取EPA，DHA的初步研究[J].中国海洋药物，1989(3)：2-3．

[3]张春艳．DHA和EPA的生理作用及开发利用研究进展[J]．柳州师专学报，2005，20(3)：3-5．

[4]闵征桥，高盼，何东平，等.尿素包合法富集鱼油EPA和DHA的工艺研究[J].粮油食品科技，2013，21(6):25-29.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版[M].北京：中国医药科技出版社，2010：272.

[6]胡小泓，潘成杰，王超，等．葵花油中不饱和脂肪酸的富集工艺研究[J]．西部粮油科技，2001，26(2)：79-80．

[7]张海满，刘福祯，戴玲妹．尿素包合法纯化γ-亚麻酸工艺研究(Ⅱ)：α-亚麻酸纯化过程正交实验研究[J].中国油脂，2001，26(3)：53-54．

[8]朱世云，包宗宏，云志，等.尿素包合法富集鱼油中的EPA和DHA的研究[J].中国油脂，1997，22(5)：54-56.

Enrichment of EPA and DHA from Fish Oil Ethyl Esterby Urea Inclusion Method

SHAN Xing-fu1，LI Jiang2，ZHENG Xiao-lin3，XU Yuan1，LIU Fa-yi1

(1.QingdaoAuhaiBiotechCo.,Ltd.，Qingdao266101,China；2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao266061,China；3.RizhaoVocationalandTechnicalCollege,Rizhao276826,China)

Keywords：fishoilethylester；eicosapentaenoicacid(EPA)；decosahexaenoicacid(DHA)；ureainclusionmethod

Abstract：Eicosapentaenoicacid(EPA)anddecosahexaenoicacid(DHA)fromfishoilethylesterwereenrichedbyanureainclusionmethod.Theoptimumenrichmentprocessobtainedbyasinglefactorexperimentandanorthogonalexperimentwereasfollows:m(urea)∶m(fishoilethylester)of1.5∶1，V(ethanol)∶m(fishoilethylester)of3∶1,inclusiontimeof1h,inclusiontemperatureof75 ℃,crystallizationtemperatureof25 ℃.Underaboveconditions,thetotalcontentofEPAandDHAfromfishoilethylesterreached85%,andtheyieldwas60%.

基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(2014T09)

收稿日期：2016-01-27

作者简介：单幸福(1983-)，女，山东菏泽人，助理工程师，研究方向：功能性油脂的合成，E-mail：shanxf@126.com；通讯作者：李江，副研究员，E-mail：lijiang@fio.org.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.013

中图分类号：TQ 645.6

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)06-0059-04