袖蝶热激蛋白HSP70的全基因组分析与进化*

房守敏

(西华师范大学生命科学学院，南充　637002)

袖蝶热激蛋白HSP70的全基因组分析与进化*

房守敏

(西华师范大学生命科学学院，南充637002)

摘要热激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是广泛分布于生物体内的重要分子伴侣，在环境应激和热适应中起着重要作用。本研究对诗神袖蝶Hsp70s进行了全基因组鉴定，共获得12个Hsp70s基因，其编码蛋白分子量均在70 kDa左右。进化分析表明，Hsp70s在分子系统发生树中聚为2类，分别为应激诱导型(HSP70)和组成型(HSC70)。诗神袖蝶和果蝇组成型Hsc70s基因存在1∶1的直系同源关系，而应激诱导型Hsp70s则同一物种聚为一枝，表明Hsc70s在诗神袖蝶和果蝇物种分化前业已发生基因扩增，而Hsp70s则是物种形成后发生世系特异扩增而产生的多个拷贝。我们对诗神袖蝶Hsp70s基因在化学感受器官中的表达进行了分析，除HmelHsp68、HmelHsp70A和HmelHsc70-2在化学感受器官中不表达或表达量极低外，其他基因均有明显的表达信号(FPKM>1)，而且在雌雄个体间具有相似的表达信号。这一研究有助于拓展我们对昆虫Hsp70s进化和功能的认识。

关键词诗神袖蝶；热激蛋白70；鉴定；序列分析；表达模式

热激蛋白(heat shock protein, HSP)是从细菌到动植物中均广泛存在的一类保守的蛋白质，在环境应激和热适应中起着重要作用[1-2]。生物体在应激反应过程中，热激蛋白能确保新合成的蛋白正确折叠，作为陪伴蛋白与变性蛋白结合，维持它们的折叠状态[3]。根据蛋白分子量大小可以分为：15-30kDa之间的小热激蛋白small HSPs、HSP60s、HSP70s、HSP90s和HSP110s五大家族[4-7]。Hsp70家族则是一类分子量大小在70 kDa左右的热激蛋白，是热激蛋白中重要的家族之一，它分布于所有生物体中，其功能和结构非常保守[8-9]。HSP70包括应激诱导基因(Stress-inducible genes, Hsp70s)和组成型热激相关蛋白(Constitutive forms-heat shock protein cognates Hsc70s)。在环境应激中，诱导型Hsp70s可能大量被诱导，以帮助生物体内蛋白正确折叠和修复损伤的蛋白，而Hsc70s可能起着持家基因的功能[1，9，10]。

一直以来，Hsp70s被认为是生物体抵抗冷和热应激的重要组成部分。研究表明，果蝇DmHsp68、DmHsp70A和DmHsp70Ba基因的上调表达与果蝇经受36℃热应激后的热耐受性相关[11]。在家蚕经历41℃和 45℃热应激后，双向电泳结果显示一些差异蛋白被鉴定为Hsp70s，并且其表达量上调了20倍左右[12]。经历热应激后，Hsp70基因mRNA水平的上调表达在多种生物中大量报道，如Drosophilamelanogaster[13，14]、D.buzzatii[15]、Anophelesgambiae(Sim et al., 2007)、Chrysomeaeneicollis[16]。近年来，昆虫经历冷应激也发现Hsp70s的诱导表达[12,17-19]。因此，Hsp70s的上调表达与生物冷和热应激适应性息息相关。

Hsp70s除了在适应极端温度的应激中起作用外，其他的应激因子(如杀虫剂)也能诱导Hsp70s的上调表达[20]。研究发现，果蝇经0.15-1.5ppb敌敌畏(dichlorvos，DV)处理后，精巢中的Hsp70 mRNA被显著的诱导[14,21]。在Cyprinuscarpio中，经chlorpyrifos (CPF)和atrazine/chlorpyrifos处理后，Hsp70mRNA(Genbank accession number: BG933934)也有显著的上调。杀虫剂处理昆虫后能引起昆虫体内发生氧化应激和炎症反应，Hsp70s的上调表达可能能修复或防止该过程中蛋白的损伤。

袖蝶属(Heliconius)是一类主要分布在南美洲，少数分布在美国南部的蝴蝶，其多剌的幼虫以西番莲属(Passiflora)的植物为食[22]。2012年，模式种诗神袖蝶Heliconiusmelpomene的基因组测序完成，主要用于缪勒拟态(Mullerianmimicry)的形成机制研究[22]。蝴蝶生存的环境较为丰富，一方面也会面临冷热应激的环境，另一方面环境中也会存在大量有害物质的污染。因此，本研究重在鉴定其基因组中Hsp70s基因，并与果蝇(Drosophilamelanogaster)进行比较，分析基因的进化特征。2013年，Briscoe等[23]对诗神袖蝶成虫化学感受组织(触角、足和口器)进行了转录组测序，为我们分析该物种Hsp70s基因的表达模式提供了便利。

1材料与方法

1.1Hsp70s基因的鉴定

根据Kanani等[24]对黑腹果蝇等物种Hsp70s的系统研究，我们从美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载了果蝇的Hsp70s的氨基酸序列。以果蝇Hsp70s为检索序列与诗神袖蝶预测的蛋白数据库和基因组(http://www.heliconius.org/)作Blastp和tBlastn同源比对。对含有潜在Hsp70s的scaffold序列用FGENESH/FGENESH+(http://linux1.softberry.com/)在线工具重新预测基因。利用在线工具Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析候选基因是否含有Hsp70s的保守域。HmelHsp70s蛋白的分子量MW/等电点pI及细胞内表达定位分别采用http://web.expasy.org/compute_pi/和http://psort.hgc.jp/form2.html预测。

1.2分子系统发生分析

采用Clusta lx1.8软件对诗神袖蝶和黑腹果蝇Hsp70s蛋白序列进行多序列比对。利用MEGA6.0[25]构建邻近系统发生树(neighbor-joining phylogentic tree)。序列中的缺失采用partial deletion(70%)删除，选用Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型计算两两序列间的遗传距离。用Bootstrap方法对分子系统发生树分支可信度检验(重复1000次)。

1.3Hsp70s基因在化学感受组织中的表达

下载诗神袖蝶成虫化学感受组织(触角、足和口器)的RNA测序数据[23]。去除低质量读序(reads)和接头后获得的clean读序。用TopHat软件[26]对每一个样品的成对读序分别与诗神袖蝶参考基因组进行比对。利用Cufflinks软件[27]计算Hsp70s基因的表达水平。表达信号值用FPKM(fragments per lilobase of transcript per million mapped reads)表示，即每百万个map上的reads中映射到外显子的每1kb上的reads个数。采用Cuffdiff程序[28]计算雌雄个体间的差异基因，以错误发现率FDR(False discovery rate)≤0.001和log2(Fold-change) 绝对值≥1为域值。

2结果与讨论

2.1诗神袖蝶Hsp70s的全基因组鉴定与进化分析

根据Kanani等[24]研究，下载了黑腹果蝇Hsp70s的蛋白序列，并在诗神袖蝶预测的蛋白数据库和基因组中同源比对检索。通过基因预测与结构域分析，最终在诗神袖蝶基因组中共鉴定出12个Hsp70s基因(表1)。由于测序导致基因组部分序列的缺失，即使通过精度较高的基因预测软件FGENESH/FGENESH+，也无法获得其中三个基因HMEL015456、HMEL002731和HMEL014751的完整编码区序列。对鉴定的Hsp70s编码蛋白分子量和等电点进行了预测，发现大部分蛋白的分子量为70 kDa左右，但HMEL006222的分子量较小，仅为52.0kDa。等电点的预测表明，所有的Hsp70s蛋白的pI值小于7.0(表1)。细胞定位结果表明，Hsp70s主要位于细胞质、核质间和内质网。

注：检索号源自http://www.heliconius.org/数据库，分子量和等电点栏“-”表示基因编码区序列不完整。

将诗神袖蝶和黑腹果蝇的Hsp70s蛋白序列构建邻近系统发生树(图1)。结果表明，热激蛋白70可明确地分为应激诱导型Hsp70s和组成型热激相关蛋白Hsc70s两个进化枝，即HSP和HSC(图1)。根据黑腹果蝇命名规则，基于进化分析对诗神袖蝶热激蛋白70基因进行了命名。结果表明，诗神袖蝶应激诱导型Hsp70s含有3个基因(表1，图1)，组成型Hsc70s含有8个基因。在果蝇基因组中应激诱导型Hsp70s和组成型Hsc70s的基因数目分别为7个和6个。组成型Hsc70s更为保守，诗神袖蝶和果蝇间存在明显的1∶1的直系同源关系，表明大部分组成型Hsc70s在诗神袖蝶和果蝇物种分化形成前已经产生。而应激诱导型Hsp70s则不同，诗神袖蝶和果蝇分别聚为两枝(图1)，暗示应激诱导型Hsp70s是物种分化形成后通过基因重复的方式产生，分化形成的时间相对较短。相对于果蝇而言，应激诱导型Hsp70s在诗神袖蝶基因组中发生较少的扩增。

节点处仅显示了>50%的Bootstrap值；热激蛋白70基因前的Hmel表示诗神袖蝶(Heliconiusmelpomene)，Dm表示黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。黑腹果蝇基因名后为对应的NCBI GenBank检索号。

图1　诗神袖蝶和果蝇Hsp70s的邻近系统发生树

2.2诗神袖蝶Hsp70s在化学感受组织中的表达

研究发现，蝴蝶触角、足和口器均存在嗅觉和味觉的感受器，因此在觅食、繁殖、趋避等过程中起着重要作用[23]。热激蛋白70作为一类重要的对环境(冷、热)和有害物质(如杀虫剂等)应激蛋白，具有维持受损蛋白的折叠状态等功能。对诗神袖蝶Hsp70s基因在化学感受组织中的表达进行了分析(表2)，初步理解其可能在化学感受组织中维持嗅觉和味觉正常生理功能中的作用。结果表明，除HmelHsp68、HmelHsp70A和HmelHsc70-2在化学感受组织中不表达或表达量极低外，其他基因均有明显的表达信号(FPKM>1)。另外，实验发现所有的基因在雌性和雄性个体触角和口器具有相近的表达信号值，绝大部分基因在雌性和雄性足中也具有相似的表达信号。Hsp70s基因雌雄无偏好性的表达模式，表明它们在雌雄个体中具有相似的生理功能。但也发现HmelHsc70-3、HmelHsc70-4和HmelHsc70-5在雌雄成虫足的表达具有显著差异，而且均是雄性高于雌性，其内在的机制暂不清楚。

目前，热激蛋白70在果蝇等模式昆虫中已有大量的研究，证实它们与物体抵抗冷和热应激相关，其表达也能被其他有毒应激因子(杀虫剂等)所诱导[20]。由于杀虫剂进入昆虫体内诱发氧化应激反应，进而对蛋白产生损伤[29]，热激蛋白70可能参与维持损伤蛋白或新合成蛋白的正常折叠。但非模式昆虫的热激蛋白70研究相对较少，而且对它们在化学感受组织中的表达研究则更少。本研究对诗神袖蝶Hsp70s的全基因组鉴定和化学感受组织中的表达模式分析，有助于拓展我们对昆虫Hsp70s进化和功能的认识。

表2　诗神袖蝶Hsp70s在嗅觉组织中的表达信号(FPKM)

注：组织后的F表示雌(female)，M表示雄(male)。

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Heat shock protein 70 (HSP70) is widely distributed in organisms, which plays important roles in environmental stresses and heat adaptation. In this study,HeliconiusmelpomeneHsp70s were identified in the whole genome, and 12 Hsp70s were characterized, whose molecular weights were all around 70 kDa. In the phylogenetic tree, heat shock protein 70 proteins were clustered into two group, including stress-induced Hsp70s and constitutive Hsc70s. Relatively, most of the Hsc70s inH.melpomeneandDrosophilamelanogastershowed 1 to 1 orthologous relationship, while stress-induced Hsp70s group clustered within each species, suggesting that Hsc70s were duplicated before speciation ofH.melpomeneandD.melanogaster. We analyzed the expressions of HmelHsp70s family in the chemosensory tissues ofH.melpomeneadults. Except forHmelHsp68,HmelHsp70A andHmelHsc70-2, all the others were expressed in those tissues (FPKM>1). This study might help us understand the evolution and function of Hsp70s in non-model species.

Key wordsHeliconiusmelpomene; Heat shock protein 70; Identification; Sequence analysis; Expression pattern

Genomic Characterization and Evolution of HSP70 inHeliconiusmelpomene

FANG Shou-Min

(CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong,Sichuan637002,China)

ABSTRACT

资助项目：西华师范大学基本科研业务费专项资金资助(No.13D001)。