石榴果皮DHQ/SDH基因的克隆及序列分析

冯立娟+焦其庆+尹燕雷

摘要：以泰山红石榴果实为试验材料，利用逆转录PCR（RT-PCR）技术扩增出980 bp大小的中间片段，用 3′cDNA 末端快速扩增PCR（RACE PCR）获得DHQ/SDH基因的3′端，拼接后获得1 585 bp的cDNA片段。结果表明，该基因含有1 265 bp编码序列（CDS），编码421个氨基酸，其氨基酸序列与苹果（注册号：XP_008370537.1）、葡萄（注册号：XP_002270232.1）、白梨（注册号：XP_009335660.1）的同源性分别为82%、84%、82%；蛋白质理论分子质量为 133 682.2 u，等電点为5.01，含量最丰富的氨基酸是丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr），具有DHQase I、SDH（AroE）2个保守结构域，为亲水性蛋白；二级结构主要由无规则卷曲（31.12%）、α-螺旋（30.17%）、伸展链（24.94%）和β-转角（13.78%）组成；GenBank登录号为KU133479。

关键词：石榴；DHQ/SDH基因；克隆；序列分析

中图分类号： S665.401；Q785 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0026-04

石榴（Punica granatum L.）是一种重要的功能性水果，富含类黄酮、酚酸和鞣花单宁等可溶性酚类物质，市场发展前景广阔[1]。没食子酸是石榴果实中重要的酚类物质，具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎抗菌[4-5]等诸多功效，生物学效应广泛[6]。莽草酸途径在植物次生代谢途径中起到中心作用，可为其他次生代谢途径提供底物。研究表明，没食子酸主要通过莽草酸途径生成的3-脱氢莽草酸代谢生成[7-8]。

脱氢奎尼酸脱氢酶（3-dehydroquinate dehydratase，简称DHQ）、莽草酸脱氢酶（shikimate dehydrogenase，简称SDH）分别催化莽草酸途径中的第3、第4步反应，在大多数微生物中，DHQ、SDH是单功能的，但是在植物中，DHQ、SDH可以融合，形成具有2种功能的酶[9]。3-脱氢奎尼酸脱氢酶（EC4.2.1.10）/莽草酸脱氢酶（EC1.1.1.25）双功能酶（bifunctional 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase，简称DHQ/SDH）能催化3-脱氢奎尼酸脱水生成3-脱氢莽草酸，也能催化3-脱氢莽草酸、莽草酸之间的可逆还原反应，是没食子酸代谢途径中的关键调控酶[10]。编码SDH结构基因aroE的克隆、表达分析和功能鉴定在结核杆菌[11-12]、谷氨酸棒杆菌[13]中已有报道。DHQ/SDH基因cDNA的片段或全长序列已在豌豆[14]、烟草[15]、番茄[16]等植物中被克隆出来，通过全基因组测序推测苹果、葡萄、白梨、桃等果树DHD/SDH基因的片段或全长已在GenBank上注册，但是关于石榴中DHQ/SDH基因的克隆及序列分析等方面的研究在国内外尚未见报道。因此，本研究以山东省主栽石榴品种泰山红为试验材料，利用逆转录PCR（RT-PCR）技术克隆DHQ/SDH基因，对其进行生物信息学分析，从而为揭示石榴果实中没食子酸代谢的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年6—9月在山东省果树研究所进行。以泰山红石榴果实为试验材料，将其定植于山东省果树研究所石榴种质资源圃。于幼果期（果实直径2～3 cm）采集石榴果实，洗净擦干后，用削皮刀取果皮，在液氮中速冻后放入 -80 ℃ 冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA第1链的合成 采用RNA Prep Pure Plant Kit[DP441，天根生化科技（北京）有限公司]提取石榴果皮的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用NanoDrop紫外分光光度计测量吸光度，计算RNA纯度，即D260 nm/D280 nm值。

以RNA溶液为模板，Oligo（dT）18为引物，根据cDNA第1链合成试剂盒说明书反转录成cDNA第1链（K1622，Thermo Scientific）。

1.2.2 基因中间片段的克隆 根据已知物种同源序列的保守片段设计兼并引物，进行PCR扩增。预计扩增片段大小为1 000 bp，上游引物DHQ/SDH 1：5′-GCVATGGAGYTVGGRGCTGATT-3′；下游引物DHQ/SDH 2：5′-GTTGTRTTBGCRAGDAYCATVCC-3′。50 μL PCR反应体系：25 μL 2×Ex Taq buffer，1 μL dNTP（10 mmol/L），各1.5 μL上、下游引物，5 μL cDNA，1.0 μL Ex Taq酶，15 μL灭菌蒸馏水。反应步骤：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段克隆至pMD18-T载体后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得中间片段序列。

1.2.3 3′cDNA末端快速扩增PCR（RACE PCR）获得基因的3′端序列 根据获得的中间片段序列设计2对特异引物，使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（634923，Clontech）试剂盒获得该基因的3′端序列。

基因特异引物：3′ DHQ/SDH1，5′-TGGTAAACTGTTTGTCGTCATGGGTGC-3′；3′ DHQ/SDH2，5′-GCCAATCGCACATATGACAAAGCCAAA-3′。下游引物为通用引物（UPM）：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。首先用引物3′ DHQ/SDH1、UPM进行第1轮扩增，以得到的PCR产物为模板，再用引物3′ DHQ/SDH2、UPM进行第2轮PCR扩增。50 μL PCR反应体系：25 μL 2×Ex Taq buffer，1 μL dNTP（10 mmol/L），各1.5 μL上、下游引物，5 μL cDNA，1.0 μL Ex Taq酶，15 μL灭菌蒸馏水。反应步骤：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段克隆至pMD18-T载体上，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得基因的3′端序列。

1.2.4 DHQ/SDH基因的生物信息学分析 分别利用NCBI的BLASTn、BLASTp进行核苷酸、氨基酸序列相似性分析，利用DNAMAN软件进行多序列比对，DHQ/SDH基因编码蛋白的理化性质采用ProtParam预测，疏水性/亲水性采用ProtScale进行预测，利用ExPaSy工具中的SOPMA软件编码蛋白的二级结构。

2 结果与分析

2.1 石榴果皮DHQ/SDH基因保守片段的克隆

用天根生化科技（北京）有限公司的RNA Prep Pure Plant Kit提取石榴果皮RNA，以反转录cDNA为模板，利用设计的兼并引物DHQ/SDH-1、DHQ/SDH-2进行PCR扩增，获得980 bp大小的DHQ/SDH基因的中间片段（图1）。Blast比对分析表明，该片段与苹果（Malus domestica）、葡萄（Vitis vinifera）、白梨（Pyrus bretschneideri）、梅花（Prunus mume）等植物的DHQ/SDH基因有较高的同源性，确认为石榴DHQ/SDH基因保守序列。

2.2 石榴果皮DHQ/SDH基因3′端序列的克隆

根据获得的保守序列设计2对特异引物，3′RACE扩增得到701 bp的片段（图1）。根据测序结果将保守序列、3′端片段拼接后得到1 585 bp的cDNA片段，该基因含有1 265 bp的编码序列（CDS），编码421个氨基酸（图2），编码的蛋白具有DHQase I、SDH（AroE）2个保守结构域（图3）。BLAST分析表明，该基因片段的核苷酸序列与苹果、葡萄、白梨、桃（Prunus persica）和欧洲大叶杨（Populus trichocarpa）等植物的相似性达到了80%以上。

经比对，该基因编码的氨基酸序列与苹果（注册号：XP_008370537.1）、葡萄（注册号：XP_002270232.1）、白梨（注册号：XP_009335660.1）、碧桃（注册号：XP_007207367.1）、梅花（注册号：XP_008246555.1）、胡杨（Populus euphratica，注册号：XP_011024056.1）、麻疯树（Jatropha curcas，注册号：XP_012089148.1）、可可（Theobroma cacao，注册号：XP_007030110.1）和巨桉（Eucalyptus grandis，注册号：XP_010025117.1）等物种的同源性在80%以上（图4），表明克隆到的片段为石榴果皮DHQ/SDH基因，GenBank登录号为KU133479。

2.3 DHQ/SDH基因的生物信息学分析

2.3.1 DHQ/SDH基因編码蛋白的理化性质、疏/亲水性分析 利用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam对DHQ/SDH基因编码蛋白的理化性质进行预测，推测该蛋白的分子式为C4970H8326N1616O2088S298，相对分子质量为 133 682.2 u，等电点（pI值）为5.01，含量最丰富的氨基酸是丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr），带正电荷（Asp+Glu）、负电荷（Arg+Lys）的氨基酸数均为0。该蛋白的不稳定系数为40.76，脂肪系数为30.82，亲水性系数为0.725。

利用在线分析软件ProtScale的Kyte andDoolittle算法对DHQ/SDH基因进行疏水/亲水性分析表明，DHQ/SDH蛋白存在明显的疏水区、亲水区，其中第268位氨基酸疏水/亲水值最高，为2.022，第300位氨基酸最低，为-2.556，为亲水性蛋白。

2.3.2 DHQ/SDH基因编码蛋白的二级结构分析 利用SOPMA软件预测石榴DHQ/SDH基因编码蛋白二级结构表明，有127个氨基酸参与形成α-螺旋（alpha helix），占总氨基酸数的30.17%；有58个氨基酸参与形成β-转角（beta turn），占总氨基酸数的13.78%；有105个氨基酸参与形成延伸链（extended strand），占总氨基酸数的24.94%；有131个氨基酸参与形成无规则卷曲（random coil），占总氨基酸数的 31.12%。结果表明，DHQ/SDH基因编码蛋白的二级结构中含有丰富的α-螺旋、无规则卷曲结构。

3 讨论与结论

DHQ/SDH双功能酶的优点就是在莽草酸途径中通过限制中间物在竞争途径中的质量而提高代谢物流通的效率[9]。苹果、白梨、葡萄等果树上DHQ/SDH基因序列主要通过全基因组测序预测得到，本研究首次利用RT-PCR技术从石榴果皮中分离得到DHQ/SDH基因3′端cDNA序列，是国际上果树DHQ/SDH基因克隆的一大突破。

氨基酸序列分析表明，石榴DHQ/SDH基因与葡萄、苹果、白梨的同源性分别为84%、82%、82%，推测石榴 DHQ/SDH 具有其他植物中DHQ/SDH的生物学功能，为进一步揭示DHQ/SDH的功能奠定了理论基础。DHQ/SDH基因具有DHQase I、SDH （AroE）2个保守结构域，DHQase I具有T细胞免疫球蛋白黏蛋白（T cell imrnunoglobulin domain and mucin domain，简称TIM）磷酸结合超家族保守结构域，莽草酸脱氢酶基因AroE蛋白具有shikimate_dh_N、NADB_Rossmann超家族保守结构域，这与Han等在异形水绵上的研究结果[17]一致。

拟南芥只有1种DHQ/SDH基因型[18]，烟草有NtDHQ/SDH1、NtDHQ/SDH2 2种基因型，二者中的任何1个受到RNA干扰（RNAi）的抑制，就能改变脱氢奎尼酸和莽草酸代谢途径的稳定水平[15]。本研究从泰山红石榴果皮中分离得到1种DHQ/SDH基因型，是否还有其他类型DHQ/SDH基因存在还须继续选择不同石榴品种进行深入研究。

DHQ/SDH的结构与功能研究主要在拟南芥、烟草等模式植物上，随着分子生物学技术的发展，不同植物DHQ/SDH基因的功能研究将不断深入。由于石榴果皮富含酚类、鞣质、糖、酸等物质，提取高纯度、完整的RNA难度较大，本试验目前提取的RNA纯度不能满足5′RACE的需要，下一步将改进试验方案，克隆得到DHQ/SDH基因全长cDNA序列。本研究比较不同石榴品种发育期果实中DHQ/SDH基因的表达与没食子酸含量的相关关系，为从分子水平揭示石榴果实没食子酸的代谢机制提供了一定的理论依据。

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