HPLC法测定白屈菜不同器官多种生物碱的质量比

邹　翔，方月妮，曲中原，石　鑫，刘　欣，汪　波，陈　敏

(1. 哈尔滨商业大学 药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；3. 哈尔滨商业大学 中药学博士后科研流动站，哈尔滨 150076)

HPLC法测定白屈菜不同器官多种生物碱的质量比

邹翔1，方月妮1，曲中原2,3，石鑫2，刘欣1，汪波1，陈敏1

(1. 哈尔滨商业大学 药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；3. 哈尔滨商业大学 中药学博士后科研流动站，哈尔滨 150076)

摘要：采用高效液相色谱法分析白屈菜不同器官生物碱的种类及质量比.取白屈菜不同器官粉碎，以甲醇∶水溶液(4∶1, V∶V)热回流提取，提取液蒸干后用50%甲醇溶液溶解，滤过后采用HPLC分析.采用Diamonsil C18色谱柱，流动相为乙腈-0.1%三乙胺水溶液(24∶76，三乙胺溶液用磷酸调至pH至3)，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为290 nm.白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱分离良好，各成分质量浓度与峰面积在测定范围内均呈良好的线性关系(r>0.999 6)，重现性良好，5种成分的RSD值(n=5)均小于2.0%；平均加样回收率(n=5)为97.78%～99.63%.白屈菜不同器官所含生物碱的种类有所差异，根、茎及果实中所含生物碱的种类较多，质量比较高.明确了白屈菜碱各器官所含主要生物碱种类，为白屈菜的合理开发和利用奠定了基础；所建立的白屈菜多种生物碱同时测定的HPLC方法稳定可靠，简便易行，可用于白屈菜药材及其制剂的质量评价.

关键词：白屈菜；不同器官；生物碱；质量比测定；高效液相色谱法

白屈菜为罂粟科白屈菜( Chelidonium majus L.) 的干燥全草，别名地黄连、牛金花、土黄连等.主要分布于东北、华北、西北地区及长江中下游等省区[1].白屈菜始载于《救荒本草》，在我国、欧洲、德国和匈牙利药典中均有收载.中药白屈菜性凉，味苦；有小毒.归肺，心，肾经.白屈菜全草功效为解痉止痛，止咳平喘，主治胃脘挛痛，咳嗽气喘，百日咳[2].白屈菜根具有散瘀、止血、止痛、解蛇毒之功效，主治劳伤瘀血，月经不调，痛经，消化性溃疡病和蛇咬伤等[3].目前研究表明异喹啉类生物碱是白屈菜的主要活性成分，主要包括原阿片碱、隐品碱、白屈菜碱、血根碱、白屈菜红碱、黄连碱、小檗碱及四氢黄连碱等[4-5].本文采用反相高效液相法同时测定白屈菜植物根、茎、叶、花、果实中白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱及黄连碱的质量比，明确白屈菜各器官中所含生物碱的种类及质量比，为全面了解白屈菜的药效物质基础提供详实的数据.

1仪器与试药

1.1仪器

Waters 高效液相色谱系统(600型泵、2996型二极管阵列检测器、717型自动进样器和Empower色谱工作站、CBL100型柱温箱)；FW100 型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；HH-2 数显恒温水浴锅(江苏省常州市恒久仪器制造有限公司)；PL203 型电子分析天平( 瑞士METTLER TOLEDO 公司) ；KQ5200DB 型数显超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JM-B2002 型电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司).

1.2试药

白屈菜红碱、小檗碱、黄连碱、血根碱(天津一方科技有限公司，质量分数98%)、白屈菜碱(深圳市美荷生物科技有限公司，质量分数98%).白屈菜植物(采自黑龙江帽儿山，批号20150420，经哈尔滨商业大学药学院张德连教授鉴定为罂粟科植物白屈菜( Chelidonium majus L.)，趁新鲜分离各器官，自然晾干).乙腈(赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)；三乙胺(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；甲醇(色谱纯)；磷酸(天津市天力化学试剂有限公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团).

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液的制备

分别精密称取白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱对照品适量，以50%甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.08、0.03、0.02、0.01、0.1 mg/mL的混合对照品储备液.

2.1.2供试品溶液的制备

取白屈菜不同器官分别粉碎，过3号筛，各取粉末5 g，置于圆底烧瓶，各精密加入50%甲醇水溶液200 mL，称定质量，热回流1.5 h，放冷，再称定质量，各以50%甲醇水溶液补充减失的重量，摇匀，滤过，各精密量取续滤液100 mL，蒸干，残渣用50%甲醇水溶液溶解，分别转移至10 mL容量瓶中，摇匀，滤过，即得.

2.2色谱条件

Diamonsil C18色谱柱，以乙腈-1%三乙胺溶液(磷酸调pH值至3.0)(24∶76)为流动相，检测波长为290 nm，进样量为10 μL，理论塔板数以白屈菜红碱计大于2 000.所测5种生物碱能很好的分离，结果见图1.

A-混合对照品　B-果实　C-花　D-叶　E-根　F-茎1-白屈菜红碱　2-白屈菜碱　3-黄连碱　4-血根碱　5-小檗碱图1　混合对照品及样品的HPLC色谱图

2.3线性关系考察

分别精密量取白屈菜混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL至5 mL容量瓶中，以50%甲醇溶液定容，制得系列混合对照品溶液.分别精密吸各混合对照品10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图.以色谱峰面积积分值为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，建立线性回归方程.结果见表1.

表15种生物碱成分线性关系考察结果

生物碱回归方程r线性范围/(μg·mL-1)白屈菜碱Y=3×107X-5125.80.99964.00～64.00白屈菜红碱Y=3×107X+458940.99981.50～24.00黄连碱Y=2×107X-48370.99965.00～80.00血根碱Y=3×107X+138590.99991.00～16.00小檗碱Y=4×107X-2775.20.99980.50～8.00

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验

取白屈菜茎供试品溶液重复进样5次，测定峰面积.白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱的峰面积RSD值分别为0.49%、0.74%、0.39%、0.88%、0.91%(n=5)，均小于2%，表明仪器精密度良好.

2.4.2稳定性实验

取白屈菜茎供试品溶液5份，分别于0、2、4、6、8、10 h 进样，测定峰面积，白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱峰面积在不同时间的RSD分别为0.44%、0.38%、0.79%、0.67%、0.91%均小于2%，供试品溶液在10 h 内稳定性好.

2.4.3重复性实验

取白屈菜茎粉末5份，按“2.1.2”项下方法制备成白屈菜茎样品溶液，按“2.2”下色谱条件，测定5种生物碱峰面积并进行计算.结果茎中白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱质量分数的RSD分别为0.73%、1.32%、0.93%、0.77%、0.66%(n=5).

2.4.4加样回收实验

取已知质量比白屈菜茎粉末(白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱质量比分别为1.33、 0.48、0.28、0.32、4.8 mg/g)5份，每份1 g，每份分别加入白屈菜碱标准品1.0 mg，白屈菜红碱0.5 mg，血根碱0.5 mg，小檗碱0.5 mg，黄连碱5.0 mg.按“2.2”项下方法测定，计算回收率.白屈菜茎中白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱的平均加样回收率分别为97.78%、99.63%、98.31%、98.56%、98.71%(n=5)，RSD分别为1.0%、1.6%、0.4%、0.9%、1.0%.

2.5样品测定与结果

取白屈菜根、茎、叶、花、果实粉末，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.2”项下方法测定不同器官中5种生物碱的质量比.结果见表2.结果表明白屈菜根、茎和果实中均含有5种生物碱，其中根中白屈菜碱质量比最高，茎中黄连碱质量比最高，果实中血根碱质量比最高；叶中只含有白屈菜红碱和黄连碱，而花中只含有白屈菜碱、白屈菜红碱及黄连碱.

表2白屈菜植物不同器官生物碱质量比

生物碱不同器官生物碱质量比/(mg·g-1)根茎叶花果实白屈菜碱5.3731.3320.5710.3435.996白屈菜红碱0.9970.480-6.1091.190血根碱1.4920.272--7.307小檗碱0.8210.319--0.121黄连碱4.3474.8001.42317.4054.100总生物碱13.037.201.9923.8618.71

3讨论

白屈菜是一味传统的中药，具有消炎镇痛、止咳利尿、抗癌抑菌以及平喘解毒等多种功效[6].目前《中国药典》白屈菜的质量标准中以白屈菜红碱的质量比为指标进行优劣评价[3].异喹啉生物碱是白屈菜的主要活性成分，除白屈菜红碱还有白屈菜碱、血根碱、黄连碱和小檗碱等生物碱，均具有良好的药理作用.其中白屈菜碱具有抗肿瘤、镇痛、解痉等作用[7]；血根碱具有抗菌、杀虫、抗肿瘤，改善肝功能等作用[8]；黄连碱具有抗真菌，保护胃黏膜，保护心肌作用[9]；小檗碱具有抗病原微生物、抗肿瘤作用，此外在心血管系统疾病方面表现出良好的活性，对糖尿病及其并发症有明显改善作用[10-11].所以，本文建立HPLC同时测定这5种生物碱的质量比对于完善白屈菜药材的质量评价方法具有一定的意义.

白屈菜是全草入药，茎、叶、花和果实不同器官中生物碱的种类和质量比是否相同，本文进行系统研究，结果表明，总生物碱质量比花>果实>茎>叶，所以一般在5～7月开花时采收地上部分较为合理.茎中5种生物碱均检测到，叶中检测到2种，花中检测到3种，果实中检测到5种，推测盛果期采收白屈菜，更利于生物碱的积累.白屈菜根作为中草药收载于《陕西中草药》，在临床应用较少.本文研究结果表明根中总生物碱质量比较高，其中白屈菜碱质量比仅次于果实中的白屈菜碱.白屈菜根作为植物药，从综合提取分离纯化活性生物碱的角度考虑具有一定的开发价值.

参考文献：

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[3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2015版第一部)[M]. 北京: 中国医学科学与技术出版社, 2015. 109.

[4]顾悦. 白屈菜质量评价研究[D]. 镇江: 江苏大学, 2010.

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[8]徐加英. 血根碱抗宫颈癌作用及其机制的研究[D]. 苏州: 苏州大学, 2013.

[9]张志辉, 邓安珺, 于金倩, 等. 黄连碱药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(17): 2750-2754.

[10]丁南南, 童珊珊, 丁丽霞, 等. 小檗碱的分析方法及药理作用研究进展[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(7): 1296-1300.

[11]马宁，肖光玲，高宇，等.HPLC法同时测定白屈菜中白屈菜碱和白屈菜红碱[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2014，30(3)：351-353.

Determination of contents of various alkaloids in different organs of Chelidonium majus L. by HPLC

ZOU Xiang1, FANG Yue-ni1, QU Zhong-yuan2,3, SHI Xin2, LIU Xin1, WANG Bo1, CHEN Min1

(1. Post Doctoral Research Center of material Medica, Harbin University of Commrce, Harbin 150076,China; 2. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 3. Post Doctoral Research Center of Material Medica, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract：To analyze the types and contents of alkaloids in different organs of Chelidonium majus L. by HPLC, different organs of Chelidonium majus L. were smashed and extracted by heat reflux extraction method with methanol∶water solution (4∶1, V∶V). The extracting solution was dried by distillation and dissolved by 50% methanol. After filtration, the sample solution was analyzed by HPLC. Diamonsil C18reverse phase column was used as chromatographic analysis column. The mobile phase was considered as acetonitrile-0.1% triethylamine (24∶76, pH value was adjusted to 3 by phosphoric acid). The flow rate was 1 mL/min, column temperature was 35 ℃ and the UV detection wave length was 290 nm. Results showed chelerythrine, sanguinarine, berberine and coptisine were well separated. The mass concentrations and peak areas of different constituents showed a good linear relationship in the range of measurement (r > 0.999 6). The experiment also showed an excellent reproducibility and the RSD (n=5) of 5 alkaloids were all less than 2.0%. The average sample adding recovery rates (n=5) were 97.78%～99.63%. There were some notable differences of the types of alkaloids in different organs of Chelidonium majus L.The types of alkaloids in roots, stems and fruits were more varied, and the contents were also higher. The types of alkaloids in different organs of Chelidonium majus L. were clarified which laid a foundation for the reasonable development and utilization of Chelidonium majus L..The developed HPLC determination method was stable, reliable, simple and convenient, which could be used for the quality evaluation of medicinal materials and preparations of Chelidonium majus L..

Key words：Chelidonium majus L; different organs; alkaloid; HPLC

收稿日期：2016-02-10.

基金项目：黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(No. UNPYSCT-2015070)；哈尔滨商业大学研究生创新项目(YJSCX2015-355HSD)；国家自然科学基金资助项目(81102858)；中国博士后科学基金项目(2013M321060)；黑龙江省博士后科研基金项目(LBH-Z11103).

作者简介：邹翔(1978-)，男，博士，副研究员，研究方向：抗肿瘤天然药物研究. 通讯作者：曲中原(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：抗肿瘤天然药物研究.

中图分类号：R284

文献标识码：A

文章编号：1672-0946(2016)03-0257-04