过表达IL-17RLM的人脐带间充质干细胞对TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用*

郭　婧，　晁　康，　唐　健，　王培培，　高　翔△

(中山大学1附属第六医院消化内科，2附属第三医院感染科，广东 广州 510000)



·论著·

过表达IL-17RLM的人脐带间充质干细胞对TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用*

郭婧1，晁康1，唐健1，王培培2，高翔1△

(中山大学1附属第六医院消化内科，2附属第三医院感染科，广东 广州 510000)

[摘要]目的： 研究过表达白细胞介素17受体样分子的人脐带间充质干细胞(IL-17RLM-hUCMSCs)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用，为炎症性肠病的干细胞治疗提供优化的种子细胞。方法: 体外分离培养hUCMSCs，利用慢病毒载体向干细胞内转入IL-17RLM基因，构建IL-17RLM-hUCMSCs。采用TNBS诱导小鼠实验性结肠炎模型，无菌取炎症小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液，在刀豆蛋白A (ConA)刺激下将淋巴细胞分别与不同浓度的IL-17RLM-hUCMSCs及hUCMSCs共培养，72 h后以淋巴细胞+ConA为阳性对照，CCK8法及CFSE标记法检测淋巴细胞的增殖情况；同时用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群(Th1、Th2、Th17及Treg)比例的改变。结果: hUCMSCs及IL-17RLM-hUCMSCs均对ConA刺激下的淋巴细胞增殖有抑制作用(P<0.05)；当MSCs/淋巴细胞为1∶1～1∶10时，MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用呈现浓度依赖性。在有效浓度范围内，IL-17RLM-hUCMSCs较hUCMSCs抑制作用更强(P<0.05)。hUCMSCs及IL-17RLM-hUCMSCs均能够下调结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的Th1和Th17细胞亚群比例，上调Treg细胞亚群比例，但IL-17RLM-hUCMSCs对Th17细胞亚群的抑制作用更显著(P<0.05)。结论: IL-17RLM-hUCMSCs 呈浓度依赖性地抑制TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞增殖，且该作用优于hUCMSCs。同时，IL-17RLM-hUCMSCs可调节T细胞亚群的免疫平衡，且抑制Th17细胞亚群作用强于hUCMSCs。

[关键词]脐带间充质干细胞； 白细胞介素17受体样分子； 淋巴细胞； 免疫调节

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因不明的慢性、复发性胃肠道炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)及溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，目前尚无理想的治疗手段，是消化领域研究的热点及难点之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有来源广泛、易于体外扩增、低免疫原性及具有组织修复和免疫调节等作用成为细胞治疗的优质种子细胞。动物实验发现，MSCs治疗实验性结肠炎模型后反映全身炎症状态的脾脏淋巴细胞免疫紊乱得以纠正[1]，小样本的临床研究亦发现，MSCs对炎症性肠病具有治疗作用[2]，但仍具争议，种子细胞的来源、培养、优化及作用机制等方面尚需进一步探讨。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是近年新兴的种子细胞，与传统骨髓来源的MSCs相比，具有操作无创、取材方便、更易于体外扩增及伦理问题少等优势，但目前在IBD治疗方面的研究尚少。

目前认为遗传易感人群在环境因素刺激下诱发的自体免疫紊乱是IBD主要机制[3]，其中炎症通路的激活是核心环节。研究发现，CD患者的Th17细胞数是正常对照组的20倍，是非活动性CD患者的4倍，活动期CD患者Th17细胞分布贯穿了黏膜层、黏膜下层以及肌层[4]；在活动期CD患者中，IL-17的表达明显上调，并且与疾病的严重程度呈正相关[5]，提示其参与IBD的发病。而抗IL-17单克隆抗体治疗可显著抑制结肠炎的发生[6]，提示阻断IL-17通路在实验性结肠炎动物模型中显示出治疗作用。IL-17主要由CD4+T细胞分泌，其家族包括6个成员(IL-17A～F)。当IL-17与其受体IL-17R结合并激活该通路时，导致趋化因子、集落刺激因子和黏附分子的表达或释放，招募和激活炎症细胞尤其是中性粒细胞，从而介导炎症并与多种细胞因子产生协同作用放大炎症反应。2003年，科学家发现了IL-17受体样分子(IL-17 receptor-like molecule, IL-17RLM或Sef)[7]，其主要为IL-17受体样蛋白与可溶性Fc受体的融合蛋白，是一种单跨膜细胞因子受体，N末端还有1个信号肽、1个跨膜结构域和1个较长的胞浆结构域，其较长的胞浆结构域还含有1个潜在的SH3互相作用结构域和众多的酪氨酸磷酸化部位，在胞浆临膜区含有1个Toll/IL-1受体样结构域。IL-17RLM通过与IL-17R相互作用可以竞争结合IL-17[8]，阻断IL-17与其受体结合以调控IL-17，为治疗IL-17通路激活导致的慢性炎症性疾病提供了新的切入点。

鉴于阻断IL-17通路和MSCs对炎症性肠病均有治疗作用，我们设想将针对IL-17的靶向治疗与细胞移植治疗结合，将MSCs进行优化，构建具有双重作用的种子细胞，增强其免疫调节功能，为炎症性肠病的干细胞治疗提供更优的种子细胞。因此，本研究构建过表达IL-17RLM基因的hUCMSCs细胞系，观察其对TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用，为进一步使用该细胞治疗IBD提供实验基础。

材料和方法

1材料

正常剖宫产的健康产妇志愿捐献的脐带标本均来自中山大学附属第六医院产科，乙肝5项、HCV、HIV、梅毒等其它相关传染性指标均呈阴性；BALB/c小鼠，SPF级，6～8周龄，雄性，体重18～22 g，购于广东省医学动物中心，实验前于中山大学北校区动物中心检测5～7 d。

2主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基和胎牛血清(Gibco)；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)、丝裂霉素C、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin)和三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)均购自Sigma；CCK-8试剂盒(Dojindo)；CFSE细胞增殖检测试剂盒(Invitrogen)；流式抗体CD29-PE-Cy5、CD44-PE、CD34-PE、CD45-PE-Cy5、CD105-PE、HLA-DR-PE-Cy5、CD3-FITC、CD8-APC、CD4-FITC、CD25-APC、IFN-γ-PE-Cy7、IL-4-PE、IL-17A-PE、Foxp3-PE、固定/破膜试剂盒及流式细胞仪(BD)；倒置显微镜(Olympus)；荧光显微镜(Leica)；多功能酶标仪(Thermo Fisher)。

3实验方法

3.1人脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定无菌条件下取脐带标本，用PBS充分冲洗并将其剪碎至1～2 mm3大小组织块，置于T75培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，放置于37 ℃、5% CO2饱和度培养箱内培养，每3 d补加新鲜培养液。当镜下观察组织块周围有成纤维状细胞出现时，去除组织块，添加培养液继续培养。约20 d后细胞生长达80%融合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后按1∶3传代培养，取对数生长期的第3～5代细胞参考国际细胞治疗协会(ISCT)确定的 MSCs判断标准[9]和国内外相关文献进行细胞鉴定。利用荧光标记CD34、CD44、CD45、CD29、CD105、HLA-DR等抗体染色，流式细胞术进行表型鉴定。成脂诱导加1 μmol/L地塞米松、10 mg/L 胰岛素、0.5 mmol/L IBMX和200 mmol/L吲哚美辛，每3 d 换液一次培养4 周，第 21天油红O染色镜检。成骨诱导加0.1 mmol/L地塞米松、50 mmol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-磷酸甘油，隔3 d 换液培养4周，茜素红染色鉴定。

3.2过表达IL-17RLM人脐带间充质干细胞的制备分析所需合成的IL-17RLM基因全序列，将扩增的IL-17RLM基因连入慢病毒表达载体(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)并进行包装(以上委托上海吉凯基因公司制备)。hUCMSCs用胰酶消化，细胞计数后按每孔2×104接种于24孔板，5% CO2、37 ℃培养过夜，第2天用培养基(含5 mg/L polybrene)按MOI=1、5、10、50、100和200稀释慢病毒，去除旧培养基，加入0.5 mL稀释的病毒液以感染h-UCMSCs，同时做eGFP阳性对照的转导。感染12 h后更换常规培养基，72 h后荧光显微镜观察eGFP表达情况，并开始药物筛选稳定转导的细胞，同时检测IL-17RLM的mRNA及蛋白表达情况。以β-actin为内参照，以不携带IL-17RLM基因的慢病毒感染的细胞为阴性对照，qPCR检测目的基因IL-17RLM表达，检测用引物序列如下：β-actin: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ (forward)，5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(reverse)；IL-17RLM: 5’-GTGCCCAGCA CCTGAATTCGA-3’(forward)，5’-TGAGGACGCTGACCACACGGT-3’(reverse)。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环;60 ℃～95 ℃熔解曲线分析。

3.3TNBS诱导实验性结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的制备取6～8周龄雄性BALB/c小鼠，按参考文献[10]的方法，经皮肤致敏7 d后用2.5 mg TNBS(50%乙醇溶解)溶液100 μL灌肠诱导结肠炎，每天观察小鼠的一般情况(体重、大便性状和大便出血情况)，于灌肠第3 天(此时炎症反应最明显)无菌摘取小鼠脾脏，用注射器内芯轻轻研磨脾脏组织至分散成单个细胞，加入红细胞裂解液裂解红细胞并用滤网过滤后制成淋巴细胞悬液备用。

3.4共培养体系的制备以方法 3.3中分离的淋巴细胞为靶细胞(T)，第3～5代hUCMSCs和IL-17RLM-hUCMSCs(预先用丝裂霉素于37 ℃预处理30 min，抑制其过度分化)作为效应细胞(E)。将一定浓度的靶细胞与相应不同浓度的效应细胞加入细胞培养板中培养，并且设置对照组(即淋巴细胞单独培养组)。

3.5CCK-8法检测共培养体系中淋巴细胞活力按MSCs/淋巴细胞=1∶1、1∶5、1∶10、1∶50和1∶100浓度将MSCs接种于96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱内培养，待其充分贴壁后，将按方法3.3分离的小鼠脾脏淋巴细胞每孔1×105接种于丝裂霉素C预处理的MSCs上，并加入2.5 mg/L ConA刺激淋巴细胞增殖。以单独培养的淋巴细胞为阴性对照，淋巴细胞+ConA为阳性对照，每组设3复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养72 h，收集各孔悬浮细胞，洗涤后移至另一96孔板中，每孔200 μL，设200 μL培养液为空白对照孔，每孔加CCK-8 10 μg，37 ℃继续培养2 h，在450 nm波长处用多功能酶标仪测定各孔吸光度(A)，并计算淋巴细胞生长指数及生长抑制率。生长抑制率(%)=(1-实验组生长指数/阳性对照组生长指数)×100%，其中生长指数=(A实验组或阳性对照组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)。

3.6CFSE标记法检测共培养体系中淋巴细胞增殖情况按3.5的方法接种MSCs，取按方法3.3分离的小鼠脾脏淋巴细胞，用 RPMI-1640培养液调整细胞浓度为 1×1010/L，加入5 μmol/L 的CFSE试剂，充分混匀后 37 ℃反应 10 min，离心弃上清，用含 10% FBS 的 RMPI-1640 培养基于37 ℃ 封闭 10 min，PBS 洗2次后每孔1×105个接种于丝裂霉素C预处理的MSCs上，加入2.5 mg/L ConA刺激淋巴细胞增殖，以单独培养的淋巴细胞为阴性对照，淋巴细胞+ConA为阳性对照，每组设3复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养72 h后收集各孔悬浮细胞，以相同来源的未经 CFSE 标记的淋巴细胞调节荧光补偿，使用流式细胞仪检测各组淋巴细胞的CFSE荧光强度。

3.7流式细胞术检测共培养后各淋巴细胞亚群比例的变化按不同比例加入小鼠脾脏淋巴细胞和MSCs至24孔培养板(淋巴细胞约每孔1×106个，MSCs/淋巴细胞比例为1∶1和1∶10)，调整体积至1 mL，分组检测Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例。用于检测Th1/Th2/Th17的细胞加入PMA(100 μg/L)、ionomycin(1 mg/L)和GolgiStop(0.7 mg/L)，于37 ℃、5% CO2培养箱刺激4 h，收集淋巴细胞悬液，PBS清洗后加入CD3-FITC、CD8-APC抗体孵育30 min，接着按固定/破膜试剂盒说明进行细胞固定和破膜，再分别加入抗IFN-γ-PE-Cy7、IL-4-PE和IL-17A-PE抗体，染色后上流式细胞仪检测；用于Treg检测的细胞无需刺激，直接收集淋巴细胞悬液，PBS清洗后加入CD4-FITC和CD25-APC抗体孵育30 min，固定破膜后加入抗Foxp3-PE 抗体，染色后上流式细胞仪检测：CD3+CD8-IFN-γ+为Th1细胞群；CD3+CD8-IL-4+为Th2细胞群；CD3+CD8-IL-17A+为Th17细胞群；CD4+CD25+Foxp3+为Treg细胞群。

4统计学处理

采用SPSS 17.0软件，根据数据是否服从正态分布，用均数±标准差(mean±SD)或者中位数及四分位数间距对其进行统计学描述。根据数据是否服从正态分布，采用秩和检验或者成组设计t检验进行两组变量之间的比较，分组多于两组时根据是否符合方差齐性的条件采用Mann-Whitney U检验或方差分析进行组间比较，进一步采用Bonferroni法进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1hUCMSCs形态学观察

组织块贴壁1周后可见贴壁组织块周围有长梭形成纤维样细胞向外游出，约15～20 d细胞达到80%～90%融合，细胞传代后形态多为梭形或三角形，随着培养时间的延长，细胞由松散变为紧密细胞形态变为均一的纺锤形，呈平行排列生长或旋涡状生长，经传代10次后，细胞仍较有活力，以1∶3传代在72 h内可长满，形态亦多呈长梭性，呈极性排列,见图1A。

2表面分子鉴定

流式细胞术检测结果显示，约90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原如CD29、CD44和CD105，但不表达造血细胞系的表面抗原如CD34、CD45和HLA-DR，说明hUCMSCs具有低免疫原性，见图1B。

Figure 1.Identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs). A: morphological changes in hUCMSCs at passage 3 (P3) and passage 5 (P5); B: detection of the surface molecules of hUCMSCs by flow cytometry; C: adipogenic differentiation of hUCMSCs (P5)invitro(oil red O staining,×400); D: osteogenic differentiation of hUCMSCs (P5)invitro(alizarin red staining).

图1hUCMSCs形态学变化及鉴定

3体外诱导分化能力

3.1成脂分化加入hUCMSCs成脂诱导液，约21 d后脂滴形成但数量较少，继续诱导，脂滴有少量的增加和增大，细胞由长梭形变为圆形或多边形，见图1C。

3.2成骨分化加入hUCMSCs成骨诱导液，诱导第5天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；第8天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积；第21天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节，见图1D。

4通过慢病毒感染实现IL-17RLM对hUCMSCs的基因修饰

过表达IL-17RLM慢病毒感染后4 d，倒置荧光显微镜观察，在MOI=100的条件下感染12 h为最佳。同时以不携带IL-17RLM基因的慢病毒感染作为阴性对照，72 h后检测目的基因IL-17RLM的表达量，qPCR结果显示hUCMSCs组和阴性对照组目的基因未见表达，携带IL-17RLM基因慢病毒感染组可见目的基因表达，见表1。免疫荧光检测目的蛋白表达可见红色荧光为IL-17RLM，绿色荧光为转染携带的eGFP，见图2。

5CCK8法检测IL-17RLM-hUCMSCs对TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞活力的抑制作用

从表2可以看出，在与MSCs共培养的条件下，ConA刺激的淋巴细胞活力受到抑制，MSCs/淋巴细胞为 1∶1～1∶10时生长指数降低(P<0.01)，且该抑制作用呈现对MSCs 浓度的依赖，hUCMSCs浓度越高，其抑制淋巴细胞增殖的作用越明显；当MSCs/淋巴细胞为1∶50～1∶100时，MSCs对淋巴细胞的生长无明显抑制作用。而图3显示当MSCs/淋巴细胞为1∶1～1∶10时，有IL-17RLM基因修饰的hUCMSCs表现出较hUCMSCs更好的抑制效果(P<0.05)。

表1慢病毒感染后IL-17RLM mRNA的表达

Table 1.The expression of IL-17RLM mRNA in the cells after lentivirus infection (Mean±SD.n=3)

Figure 2.The expression of IL-17RLM protein in the cells after lentivirus infection. A: observation under fluorescence microscope 4 d after lentivirus infection (×200); B: the expression of IL-17RLM in the cells after lentivirus infection (×100).

图2慢病毒感染后IL-17RLM 蛋白的表达

表2CCK-8法和CFSE标记法检测MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用

Table 2.Inhibitory effects of mesenchymal stem cells on the proliferation of lymphocytes by the methods of CCK8 assay and CFSE labeling (Mean±SD.n=3)

*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes+ConA group;#P0.05,##P<0.01vshUCMSCs+lymphocytes+ConA group.

Figure 3.The inhibitory effects of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs on the viability of lymphocytes detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vshUCMSCs+lymphocytes+ConA group

图3CCK8法比较相同浓度IL-17RLM-hUCMSCs与hUCMSCs对淋巴细胞活力的抑制作用

6流式细胞术检测CFSE标记的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的增殖情况

结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞单独培养时，细胞增值率低；经ConA激活后，细胞增殖率明显升高；淋巴细胞与MSCs 共培养后，当MSCs/淋巴细胞为1∶50～1∶100时，MSCs对淋巴细胞的增殖无明显抑制作用；当MSCs/淋巴细胞为1∶1～1∶10时，hUCMSCs可抑制淋巴细胞的增殖，且该抑制作用呈浓度依赖性，MSCs 浓度越高，其抑制淋巴细胞增殖的作用越明显见图4、5。而图6显示当MSCs/淋巴细胞为1∶1～1∶5时，IL-17RLM基因修饰的hUCMSCs表现出较hUCMSCs更好的抑制效果(P<0.05)，这与用CCK-8法检测的结果相符(表2)。

7IL-17RLM-hUCMSCs对结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞亚群百分比的影响

图7及表3结果分析可见MSCs 对Th1和Th17细胞亚群有抑制作用并具有量效关系(P<0.05)；图8及表3结果可见MSCs对Treg细胞亚群则具有上调作用，但未表现出量效差异；而对Th2细胞亚群无显著影响(图9)。在有作用差异的Th1、Th17和Treg细胞亚群中比较IL-17RLM-hUCMSCs与hUCMSCs作用效果，图9显示当MSCs/淋巴细胞为1∶1时IL-17RLM-hUCMSCs对Th17细胞亚群的抑制作用更为显著(P<0.05)，而对Th1和Treg细胞亚群作用的差异未见统计学显著性；当MSCs/淋巴细胞为1∶10时，IL-17RLM-hUCMSCs和hUCMSCs对Th1、Th17和Treg细胞亚群作用的差异均未见统计学显著性。

Figure 4.The effect of IL-17RLM-hUCMSCs on the proliferation of CFSE-labeled lymphocytes detected by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes+ConA group.

图4流式细胞术检测IL-17RLM-hUCMSCs对CFSE标记的淋巴细胞增殖的影响

Figure 5.The effect of hUCMSCs on the proliferation of CFSE-labeled lymphocytes detected by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes+ConA group.

图5流式细胞术检测hUCMSCs对CFSE标记的淋巴细胞增殖的影响

Figure 6.The effects of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs on the proliferation of CFSE-labeled lymphocytes. Mean±SD.n=3.#P<0.05vshUCMSCs+lymphocytes+ConA group.

图6比较相同浓度IL-17RLM-hUCMSCs与hUCMSCs对CFSE标记的淋巴细胞增殖的影响

讨论

目前研究发现hUCMSCs具有低免疫原性和免疫调节作用，且其作用不受主要组织相容性复合物的限制，不须经过严格配对使用，可用于不同个体之间的移植[11-12]。hUCMSCs因易于获得及体外易于扩增而成为新兴的优质种子细胞。体外实验将hUCMSCs与人外周血T淋巴细胞共培养，发现其可显著抑制 T 淋巴细胞的增殖及γ-干扰素的分泌，提示hUCMSCs可以通过抑制Th1型细胞因子分泌来减轻炎症反应的发生[13]，但该类研究较少，且各研究建立的反应体系不同，实验方法差异较大，研究结论不统一。本实验采用炎症性肠病的经典动物模型——TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠模型[14]，观察hUCMSCs对异体脾脏淋巴细胞的免疫调节作用，发现hUCMSCs可明显抑制ConA刺激的炎症小鼠脾脏淋巴细胞增殖，该抑制作用表现为对hUCMSCs的浓度依赖性，hUCMSCs浓度越高，其抑制作用越强，且其抑制作用基本局限在 hUCMSCs/淋巴细胞为 1∶1～1∶10的范围，当hUCMSCs浓度进一步降低时未表现出对淋巴细胞增殖的抑制作用。体外共培养后发现，hUCMSCs能够调节T细胞免疫平衡，这与近年来hUCMSCs的免疫调节作用研究结果相符。此外，我们的研究发现在人脐带中hUCMSCs的收获量较骨髓来源更高，相较其它来源的MSCs其取材更为方便、对供者无损伤、不受伦理限制，易于外源基因转染并能稳定表达目的蛋白，在有限扩增后其生物学特性能够保持不变，提示hUCMSCs作为种子细胞在细胞治疗方面的应用前景。

*P<0.05,**P<0.01vslymphocytes group.

Figure 7.The effect of mesenchymal stem cells on the proportion of Th1, Th2 and Th17 subsets of spleen lymphocytes in the mice with TNBS-induced colitis determined by flow cytometry analysis. A: the proportion of Th1, Th2 and Th17 subsets of spleen lymphocytes in mice with TNBS-induced colitis; B: the effect of mesenchymal stem cells on the proportion of Th1, Th2 and Th17 subsets of spleen lymphocytes in mice with TNBS-induced colitis.

图7流式细胞术检测MSCs对TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞Th1、Th2和Th17细胞亚群的影响

Figure 8.The effect of mesenchymal stem cells on the proportion of Treg subsets of spleen lymphocytes in mice with TNBS-induced colitis determined by flow cytometry analysis.

图8流式细胞术检测MSCs对TNBS诱导的结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞Treg细胞亚群的影响

同时，我们将这一新兴的细胞进行优化，开创性地引入靶向治疗与细胞治疗相结合的新设想，构建了过表达IL-17RLM的hUCMSCs，观察其对结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用，发现在有效浓度范围内，IL-17RLM-hUCMSCs可明显抑制ConA刺激的炎症小鼠脾脏淋巴细胞增殖，且可以下调Th1、Th17细胞比例，上调Treg细胞比例，使Th1/Th2降低，Treg/Th17升高，提示IL-17RLM基因修饰的hUCMSCs仍能保持干细胞原有的免疫调节特性。此外，IL-17RLM-hUCMSCs对结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞增殖表现出较hUCMSCs更强的抑制效果。我们进一步研究发现IL-17RLM-hUCMSCs可且对Th17细胞的下调作用更为明显，提示IL-17RLM基因修饰的hUCMSCs在具备干细胞原有免疫调节作用的同时，可产生IL-17RLM与IL-17R相互作用，影响内源性IL-17与其受体结合，从而抑制IL-17对下游炎症因子及趋化因子的激活从而调节免疫反应。

Figure 9.The effect of mesenchymal stem cells on the proportion of T lymphocyte subsets. A: the effects of different concentrations of IL-17RLM-hUCMSCs on the proportion of T lymphocyte subsets; B: the effects of different concentrations of hUCMSCs on the proportion of T lymphocyte subsets; C: the effects of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs on the proportion of T lymphocyte subsets when MSCs/lymphocytes=1∶1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsIL-17RLM-hUCMSCs+lymphocytes (1∶10) group;#P<0.05vshUCMSCs+lymphocytes group.

图9MSCs对炎症小鼠脾脏T细胞亚群比例的影响。

综上所述，IL-17RLM-hUCMSCs在体外实验中显示出对实验性结肠炎小鼠脾脏淋巴细胞具有免疫调节作用，且优于hUCMSCs，可能成为炎症性肠病细胞治疗的优质种子细胞，但本实验仅限于体外研究，进一步体内实验及机制研究尚需进行。

[参考文献]

[1]Liang L, Dong C, Chen X, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells ameliorate mice trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis[J]. Cell Transplant, 2011, 20(9):1395-1408.

[2]Duijvestein M, Vos AC, Roelofs H, et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment for refractory luminal Crohn's disease: results of a phase I study[J]. Gut, 2010, 59(12):1662-1669.

[3]Strober W, Fuss I, Mannon P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease[J]. J Clin Invest, 2007, 117(3):514-521.

[4]Fujino S, Andoh A, Bamba S, et al. Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2003, 52(1):65-70.

[5]Nielsen OH, Kirman I, Rüdiger N, et al. Upregulation of interleukin-12 and -17 in active inflammatory bowel di-sease[J]. Scand J Gastroenterol, 2003, 38(2):180-185.

[6]Marwaha AK, Leung NJ, McMurchy AN, et al. TH17 cells in autoimmunity and immunodeficiency: protective or pathogenic?[J]. Front Immunol, 2012, 3:129.

[7]Tsang M, Friesel R, Kudoh T, et al. Identification of Sef, a novel modulator of FGF signalling[J]. Nat Cell Biol, 2002, 4(2):165-169.

[8]Rong Z, Wang A, Li Z, et al. IL-17RD (Sef or IL-17RLM) interacts with IL-17 receptor and mediates IL-17 signaling[J]. Cell Res, 2009, 19(2):208-215.

[9]Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the international society for cellular therapy position statement[J]. Cytotherapy, 2006, 8(4):315-317.

[10]Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, et al. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation[J]. Nat Protoc, 2007, 2(3):541-546.

[11]Le Blanc K, Tammik L, Sundberg B, et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex[J]. Scand J Immunol, 2003, 57(1):11-20.

[12]Consentius C, Reinke P, Volk HD. Immunogenicity of allogeneic mesenchymal stromal cells: what has been seeninvitroandinvivo[J]. Regen Med, 2015, 10(3):305-315.

[13]周长辉，田毅，杨波，等. 人脐带沃顿胶间充质干细胞对人外周血T淋巴细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(14):2485-2491.

[14]te Velde AA, Verstege MI, Hommes DW. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis[J]. Inflamm Bowel Dis, 2006, 12(10):995-999.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Immunomodulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells with interleukin-17 receptor-like molecule overexpression on spleen lymphocytes from mice with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis

GUO Jing1, CHAO Kang1, TANG Jian1, WANG Pei-pei2, GAO Xiang1

(1DepartmentofGastroenterology,TheSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity;2DepartmentofInfectiousDiseases,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510000,China.E-mail:helengao818@163.com)

[KEY WORDS]Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Interleukin-17 receptor-like molecule; Lymphocytes; Immunomodulation

[ABSTRACT]AIM: To investigate the immunomodulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells with interleukin-17 receptor-like molecule overexpression (IL-17RLM-hUCMSCs) on the spleen lymphocytes from the mice with trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis for providing optimal seed cells to treat inflammatory bowel disease. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical cord. TheIL-17RLMgene was transferred into mesenchymal stem cells by lentivirus vector to establish IL-17RLM-hUCMSCs. The experimental colitis mice were induced by TNBS enema, and the spleen lymphocyte suspension was isolated. The lymphocytes were co-cultured with different concentrations of IL-17RLM-hUCMSCs and hUCMSCs under the stimulation of concanavalin A (ConA) for 72 h. The proliferation of lymphocytes was detected by the methods of CCK8 assay and CFSE labeling with lymphocytes+ConA as positive control. The changes of lymphocyte subsets (Th1, Th2, Th17 and Treg) were examined by flow cytometry.RESULTS: Both hUCMSCs and IL-17RLM-hUCMSCs inhibited T-cell proliferationinvitroco-culture system (P<0.05). When the ratios of MSCs to lymphocytes ranged from 1∶1 to 1∶10, the inhibitory rates were in a dose-dependent manner. IL-17RLM-hUCMSCs showed higher inhibitory rate than hUCMSCs within the effective concentration range (P<0.05). Both hUCMSCs and IL-17RLM-hUCMSCs reduced the proportions of Th1 and Th17 cell subsets and increased Treg cell population of spleen lymphocytes from TNBS-induced colitis mice, and IL-17RLM-hUCMSCs showed a stronger inhibitory effect on Th17 cell subset (P<0.05). CONCLUSION: IL-17RLM-hUCMSCs remarkably inhibit the proliferation of spleen lymphocytes from TNBS-induced colitis mice in a dose-dependent manner. Meanwhile, they regulate immune balance of T cells and have stronger inhibitory effect on Th17 subset.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 0961- 10

[收稿日期]2016- 02- 17[修回日期] 2016- 05- 09

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No．81370498)

通讯作者△Tel： 020-38254101； E-mail： helengao818@163.com

[中图分类号]R392.32

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.001