PEITC对人鼻咽癌CNE- 1/ CNE- 2细胞凋亡作用及机制研究

张功学，王明华，李道坤

（1.湖北文理学院附属枣阳医院病理科，湖北枣阳441200；2.湖北文理学院分子医学中心，湖北襄阳441053）



PEITC对人鼻咽癌CNE- 1/ CNE- 2细胞凋亡作用及机制研究

张功学1，王明华1，李道坤2*

（1.湖北文理学院附属枣阳医院病理科，湖北枣阳441200；
2.湖北文理学院分子医学中心，湖北襄阳441053）

摘要：目的：观察PEITC（异硫氰酸苯乙酯）对人鼻咽癌CNE-1/2细胞生长的影响以及对正常鼻咽部上皮细胞的毒性作用，探讨其抗肿瘤作用机制.方法：MTT法测定PEITC对CNE-1/2细胞生长的抑制作用；流式细胞仪检测PEITC对CNE-1/2细胞凋亡和氧化还原水平的影响；NAC阻断后其氧化还原水平的变化.结果：PEITC能抑制CNE-1/2细胞生长，随时间延长和剂量增加肿瘤细胞数明显减少，CNE-2凋亡作用更加明显，而对NP-69细胞组细胞毒性较低.当10.0 mg·ml-1PEITC在96 h时间点，NP-69细胞组IC50（12.62±0.52）与CNE-1组（3.57±0.34）、CNE-2细胞组IC50（2.64±0.20）差异具有统计学意义（P＜0.01）；用Annexin V/PI染色流式细胞检测各组细胞经PEITC处理24 h后细胞发生凋亡，随着PEITC浓度（0、5.0、10.0 mg·ml-1）的增加，细胞凋亡率增加；当PEITC 10.0 mg·ml-1浓度时，CNE-1/CNE-2凋亡率与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）；DCFH-DA探针标记后流式检测活性氧水平结果显示：CNE-1/CNE-2活性氧水平分别在6、12h时间点与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）；Rhodamine-123试剂盒测定线粒体膜电位显示：10.0 mg·ml-1浓度PEITC时CNE-1/CNE-2线粒体膜电位在24 h时间点与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）；用NAC预处理各组细胞后检测细胞活性氧及线粒体膜电位均出现反向作用.结论：PEITC能抑制人鼻咽癌CNE-1/2细胞的生长，同时对NP-69细胞具有低毒性，其抗肿瘤作用可能与其干扰细胞内的氧化还原反应，诱导细胞凋亡有关.

关键词：异硫氰酸苯乙酯；鼻咽癌；细胞凋亡

异硫氰酸酯（isothiocyanate，ITC）是天然存在于花椰菜、橄榄等十字花科蔬菜中的一类含有-N=C=S结构的有机化合物，其中异硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是研究最广泛一种.流行病学和实验研究表明，PEITC与其它的ITC可能是具有应用前景的癌症化学性预防药物，有研究报道［1-4］，十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐对啮齿类动物肝癌、乳腺癌等有明显的阻断作用；同时根据流行病学资料显示，摄入膳食异硫氰酸盐的确降低人患癌症的风险.虽然异硫氰酸盐的结构并不一致，但其对肿瘤细胞的抑制作用的机理却大致相同，目前文献中普遍认同以下两方面作用［5-7］，即异硫氰酸盐可通过抑制激活致癌因子的Ⅰ相酶和诱导Ⅱ相解毒酶防止基因损伤；其次通过促进细胞凋亡和对细胞生长周期的阻碍，从而抑制癌细胞的生长［8］，然而其化学性预防功能的确切机制还没有得到充分的了解.

本研究将选取鼻咽癌细胞，采用不同浓度的PEITC进行处理，用MTT法检测PEITC对人鼻咽癌细胞株的生长抑制作用及正常鼻咽部上皮细胞的毒性；Annexin-V/PI试剂盒检测肿瘤细胞凋亡；用DCFH-DA探针以及Rhodamine 123测试剂盒检测细胞内活性氧水平及线粒体膜电位；同时用NAC预处理各组肿瘤细胞，检测其活性氧水平及线粒体膜电位的变化以揭示PEITC抗肿瘤作用机制，从而为抗肿瘤药物的研究与开发提供指导.

1　材料与方法

1.1细胞

人鼻咽癌细胞株CNE-1（高分化）、CNE-2（低分化）、正常人鼻咽部上皮细胞NP-69.由本实验室传代保种.

1.2药品与仪器

PEITC（购自美国Sigma-aldrich公司，纯度≥99%，用DMSO溶解至终浓度为100 mg·ml-1，4℃保存备用），NAC（N-乙酰半胱氨酸，Sigma公司产品），MTT（噻唑蓝，Sigma公司产品），DCFH-DA（2′-7′二氯荧光黄双乙酸盐，Sigma公司产品），RPMI-1640培养液、新生牛血清（Gibco公司产品）；其余试剂为分析纯；Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒（KeyGene公司产品，中国南京），Rhodamine 123检测试剂盒（KeyGene公司产品，中国南京）；流式细胞仪FC 500 MCL（Beckman Coulter公司，美国）.

1.3细胞培养

鼻咽癌CNE-1/2细胞由本实验室传代保种，用内含10%新生牛血清、200 U/mL青霉素、200μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液，置5%CO2、37℃培养箱培养；正常鼻咽部上皮细胞NP-69采用200 U/mL青霉素、200μg/mL链霉素的Keratinocyte-SFM培养液（含EGF、PBE），置5%CO2、37℃培养箱培养.

2　实验方法

2.1MTT法检测PEITC对鼻咽癌细胞生长抑制作用

将处于对数生长期的CNE-1、CNE-2、NP-69细胞接种于96孔板，5×103个细胞/孔，在37℃、5%CO2条件培养箱中培养24h，分别加入不同浓度的PEITC（终浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg·ml-1）培养液；另设细胞对照组（只加细胞+DMSO不加药）.每组剂量设6个复孔，每孔总体积为200 uL.分别培养24、48、72、96h，每孔加20 μL的MTT溶液（5mg /mL），继续培养4h，弃去上清，加入DMSO 150μL/孔，振摇5 min，于570 nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率，Bliss法计算半数抑制浓度（IC50）值.实验重复3次.细胞生长抑制率= 1-A给药组/A对照组×100%

2.2Annexin-V/PI凋亡试剂盒检测PEITC对鼻咽癌细胞凋亡率

Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，能够在Ca2+存在的情况下，与细胞表面外膜的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸暴露在细胞膜外是细胞凋亡的早期事件，PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合，通过Annexin-V/PI双色标记可以检测细胞凋亡.将对数生长期的CNE-1、CNE-2细胞以每孔5×105个的密度接种到6孔板中，加不同浓度（5.0，10.0 mg·ml-1）的PEITC，设立对照，培养24 h后，收集各处理组细胞，以PBS洗涤2次，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，并加入Annexin-V和PI染液各5μL，轻轻混匀，置冰上避光反应15 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡率.

2.3线粒体活性氧检测

DCFH-DA探针可穿过细胞膜被酯酶水解生成DCFH.细胞内的活性氧可以将无荧光的DCFH转化为有荧光的DCF.因此，DCF的荧光强度可以反映细胞内活性氧的水平.取5×105个对数生长期CNE-1、CNE-2细胞接种于6孔板，设立对照，加入10.0 mg·ml-1的PEITC分别作用6、12h后收集细胞，1500 r·min-1离心5 min，用PBS洗3次后重悬，加入DCFH-DA荧光探针，室温下避光染色30 min，离心弃去上清，用PBS洗2遍，流式细胞仪检测细胞内活性氧水平的变化.

2.4线粒体膜电位的检测

采用Rhodamine-123试剂盒测定线粒体膜电位，Rhodamine-123是一种可以通透细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获，并且对细胞没有任何毒性.其荧光强度与膜电位相关，测定荧光强度即可得到膜电位.取5×105个对数生长期CNE-1、CNE-2细胞接种于6孔板，设立对照，加入10.0 mg·ml-1的PEITC分别作用24 h后收集细胞，1500 r·min-1离心5 min，用PBS洗3次后重悬，加入20μl Rhodamine-123避光染色（终浓度5mg/ml），37℃避光孵育30分钟，弃去上清液，流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位的变化.

2.5NAC对PEITC对CNE-1、CNE-2细胞凋亡的阻断作用

NAC是一种强大的抗氧化剂，能够阻断氧化还原反应.将对数生长期的CNE-1、CNE-2细胞以每孔5×105个的密度接种到6孔板中，分别用10.0 mg·ml-1的PEITC以及10.0 mg·ml-1PEITC+NAC与CNE-1、CNE-2培养24 h，并设立对照，收集各处理组细胞，以PBS洗涤2次，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，并加入Annexin-V和PI染液各5μL，轻轻混匀，置冰上避光反应15 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡率.

2.6统计处理

数据用x±s表示，采用统计软件SPSS 10. 0进行数据处理，组间数据采用t检验或秩和检验.

3　实验结果

3.1MTT检测PEITC对CNE-1、CNE-2细胞生长抑制

由细胞生长抑制率可见，CNE-1、CNE-2、NP-69细胞经不同浓度的PEITC处理后，呈现出时间和剂量依赖性，随时间延长和剂量增加细胞数明显减少（图1A-1C），并且各组中相对CNE-1而言，CNE-2随PEITC浓度增加和时间延长更敏感，而对NP-69细胞组细胞毒性较低（图1C）.当加入10.0 mg·ml-1

PEITC（图1D）在96 h时间点NP-69细胞组IC50（12.62±0.52）与CNE-1组（3.57±0.34）、CNE-2细胞组IC50（2.64±0.20）差异具有统计学意义（P＜0.01）.

图1 MTT检测PEITC对CNE-1、CNE-2细胞生长抑制

3.2Annexin V/PI染色后流式检测PEITC诱导细胞凋亡

Annexin V/PI染色后流式可检测出不同细胞群即：正常细胞群、凋亡细胞群和坏死细胞群. PEITC作用24 h后，诱导细胞发生凋亡（图2），CNE-1（图2A-2C）、CNE-2（图2E-2G）随着PEITC浓度（0、5.0，10.0 mg·ml-1）的增加，细胞凋亡率也增加；当PEITC 10.0 mg·ml-1浓度时，CNE-1（图2D）、CNE-2（图2H）其凋亡率与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）.

图2 Annexin V/PI染色后流式检测PEITC诱导细胞凋亡

3.3PEITC对细胞活性氧的影响

DCFH-DA探针标记后流式检测结果如下图3，当加入10.0 mg·ml-1的PEITC分别作用0、6、12h后流式检测CNE-1（图3A-3C）、CNE-2（图3E-3G）显示：CNE-1（图3D）、CNE-2（图3H）活性氧水平分别在6、12h时间点与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）.

图3 PEITC对细胞活性氧的影响

3.4 PEITC降低细胞线粒体膜电位检测

Rhodamine-123试剂盒测定线粒体膜电位如图4：当加入不同浓度（0、10.0 mg·ml-1）的PEITC作用24 h后流式检测CNE-1（图4A-4B）、CNE-2（图4D-4E）显示：加入10.0 mg·ml-1浓度PEITC时CNE-1（图4C）、CNE-2（图4F）线粒体膜电位在24 h时间点与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01）.

图4 PEITC降低细胞线粒体膜电位检测

3.5NAC对CNE-1、CNE-2细胞凋亡的阻断作用检测

分别加入10.0 mg·ml-1PEITC以及10.0 mg·ml-1PEITC+NAC与CNE-1、CNE-2培养24 h后，Annexin V/PI染色流式检测结果如图5：CNE-1（图5A-5D）、CNE-2（图5F-5I）分别代表对照组、10.0 mg·ml-1PEITC组、NAC组、10.0 mg·ml-1PEITC+NAC组流式检测结果，由图5E、图5J显示，10.0 mg·ml-1PEITC+ NAC组与10.0 mg·ml-1PEITC组差异具有统计学意义（P＜0.01）；而10.0 mg·ml-1PEITC+NAC组与对照组、NAC组差异不具有统计学意义（P＞0.05）.

图5 NAC对CNE-1、CNE-2细胞凋亡的阻断作用检测

4　讨论

近几十年来，肿瘤作为一种涉及到多基因，多步骤的疾病，在国内外引起了广泛的重视.尽管近年来在肿瘤的预防与治疗上取得了较大的成就，但是恶性肿瘤所引起的死亡率依然居高不下，因此提高肿瘤的治愈率及减少恶性肿瘤所引起的死亡率仍然任重道远，其预防和治疗一直是医疗科研界一个未能攻克的难题，微创治疗和靶向药物治疗是肿瘤治疗的发展趋势，开发高效低毒的靶向抗肿瘤药物将具有广泛的市场前景.而近年来随着研究的不断深入，人们发现在日常可食用的植物中即含有多种抗肿瘤活性成分，比如葡萄中含有的漆树黄酮，绿茶当中含有的茶多酚，蜂蜜当中含有的酶，十字花科植物如花椰菜中含有的异硫氢酸盐等等.由于这些抗肿瘤活性成分的提取物大多来自于日常所食用的蔬菜，所以目前的基础研究显示这些成分相对于肿瘤细胞而言，对正常细胞表现出较低的毒性，从而使得这一领域成为目前研究的热点.尽管目前有越来越多的来自于光化学植物的抗肿瘤活性成分被报道，但是受原料来源，合成技术要求以及抗肿瘤效果的限制，目前仅有少量抗肿瘤活性成分在进行深入的研究，来自于花椰菜的异硫氢酸盐就是其中的典型的代表.多年累积的研究表明，异硫氢酸盐在体内外对人多种肿瘤具有抗肿瘤活性，而对正常细胞却无明显毒性，机制研究表明异硫氰酸盐主要通过降低肿瘤细胞内的谷胱甘肽来诱导氧化还原失衡从而发挥抗肿瘤作用.而考虑到相对于人正常细胞而言肿瘤细胞中所普遍存在的氧化还原失衡现象，这也不难解释异硫氰酸盐所具有的广谱抗肿瘤作用.正是由于其独特的作用机理以及高效低毒等特点，对异硫氢酸盐抗肿瘤的研究在美国目前已进入一期临床试验，初步试验结果令人鼓舞，同时目前国内外也有研究人员开始对异硫氢酸盐化合物进行结构改造与化学合成，从而获得抗肿瘤活性更强的异硫氢酸盐化合物，这些研究都表明以来自于十字花科植物的抗肿瘤活性成分如异硫氢酸盐为先导化合物在抗肿瘤药物研发当中所具有的优势与潜力.美国抗癌协会报道：研究人员从大白菜和花椰菜等十字花科类蔬菜中提取的芳香异硫氰酸和乙硫酚酮成分，具有明显的抗癌作用.据统计常吃花椰菜能够减少前列腺癌的发生率，其具有明显预防前列腺癌的作用，每天吃花椰菜一次的男性被调查者相比每周吃不到花椰菜者，可能被诊断患有侵润性前列腺癌的风险减少52%，日本癌症研究所通过对40多种蔬菜成分分析及抑制癌细胞生长试验，花椰菜对癌症抑制率达92.8%.

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是鼻咽部最常见恶性肿瘤，目前认为本病发生与遗传易感性、环境因素和EB病毒（EBV）感染作用有关.鼻咽癌是肿瘤研究的一个很好的模型，因为它是一种典型的、发病因素比较明确的、“遗传－环境－病毒”三大类因素交互作用而形成的恶性肿瘤.因此本研究选取鼻咽癌细胞作为研究对象，力求进一步揭开PEITC抗肿瘤机制的神秘面纱.本研究结果显示，PEITC对NPC细胞高、低分化均具有诱导凋亡作用，而且具有时间-剂量依赖关系，随时间、剂量增加，凋亡作用增强，并且对低分化肿瘤细胞凋亡作用更加强烈，而对正常的鼻咽部上皮细胞毒性较低，变化较小，显示了其抗肿瘤作用及低毒副作用；同时通过PEITC对NPC高、低分化细胞活性氧及线粒体膜电位检测及NAC阻断作用后相关指标的检测，结果显示PEITC抗肿瘤作用机制可能与降低了氧化还原水平，干扰了线粒体功能有关，本研究将进一步检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达及其关系，从而进一步揭示其诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制，为肿瘤的预防和治疗提供实验基础.

参考文献：

［1］AKAGI K，SANO M，OGAWA K，et al. Involvement of toxicity as an early event in urinary bladder carcinogenesis induced by phenethyl isothiocyanate，benzyl isothiocyanate，and analogues in F344 rats［J］. Toxicol Pathol，2008，31（4）∶388-396.

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［3］GUPTA P，SRIVASTAVA S K. Antitumor activity of phenethyl isothiocyanate in HER2 -positive breast cancer models［J］. BMC Med，2012（10）∶80.

［4］SAKAO K，DESINENI S，HAHM E R，et al. Phenethyl isothiocyanate suppresses inhibitor of apoptosis family protein expression in prostate cancer cells in culture and in vivo［J］. Prostate，2012，72（10）∶1104-1116.

［5］WOGAN G N，HECHT S S，FELTON J S，et al. Environmental and chemical carcinogenesis［J］. Semin Cancer Biol，2014，14（6）∶473-486.

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（责任编辑：徐杰）

Role and Mechanism of Phenethyl Isothiocyanate on Apoptosis of Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE- 1/2

ZHANG Gongxue1，WANG Minghua1，LI Daokun2
（1.The First People's Hospital of Zaoyang City Affiliated to Hubei University of Arts and Science，Zaoyang 441200，China；2. Molecular Medicine Center，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，China）

Abstract:Objective∶to investigate the effect and mechanism of phenethyl isothiocyanate（PEITC）on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-1/2 cell，and the influence of the toxic effects of normal nasopharyngeal epithelial cells，to discuss its antitumor mechanism. Methods∶determination of PEITC CNE-1/2 cell growth inhibition by MTT method；detection of PEITC on CNE-1/2 cell apoptosis and the influence of oxidation reduction level by flow cytometry instrument；the change of oxidation reduction level after NAC is blocked. Results∶PEITC can inhibit the growth of CNE- 1/2 cell∶with the time extension and the dose increase，tumor cells significantly reduced，CNE-2 apoptosis effect become more apparent，with low cytotoxicity to NP - 69 cell group. After treated 96 h with 10.0 mg. ml -1 PEITC，the IC50（12.62±0.52）of NP - 69 cell group，the IC50（3.57±0.34）of CNE-1 group，the IC50（2.64±0.20）of CNE-2 cell groups are statistically significant different（P＜0.01）；Annexin V/PI staining flow detection PEITC effect after 24 h after cells apoptosis，as PEITC concentration（0，5.0，10.0 mg. ml-1）increased，cell apoptosis rate increased；When PEITC 10.0 mg. ml-1concentration，CNE-1/2 apoptosis rate and the control group differences statistically significant（P＜0.01）；DCFH - DA probe results showed that current detecting reactive oxygen levels，respectively at 6 and 12 h time points and the control group differences statistically significant（P＜0.01）；Rhodamine-123 kit determination of mitochondrial membrane potential shows that∶when the concentration of 10.0 mg. ml-1，CNE - 1/2 of mitochondrial membrane potential in 24 h time point and the control group differences statistically significant（P＜0.01）；With NAC pretreatment groups of cells after testing reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential in reverse. Conclusion∶PEITC can inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma CNE-1/2 cells，has low toxicity to the cells of NP - 69 at the same time，its antitumor effect may be related to interference intracellular REDOX reaction，induction of apoptosis.

Key words:Phenethyl isothiocyanate；Nasopharyngeal carcinoma；Apoptosis

中图分类号：R361.3

文献标志码：A

文章编号：2095-4476（2016）05-0078-07

收稿日期：2016-03-14；

修订日期：2016-05-09

基金项目：襄阳市科技局项目（襄科业［2013］66号）

作者简介：张功学（1970—），男，湖北襄阳人，湖北文理学院附属枣阳医院病理科主任医师.

*通讯作者