蝴蝶兰F3′5′H基因转化OT杂种百合Robina的研究

刘爱玲,刘雅莉,娄　倩,张海芹

(西北农林科技大学 旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵,712100)

蝴蝶兰F3′5′H基因转化OT杂种百合Robina的研究

刘爱玲,刘雅莉*,娄倩,张海芹

(西北农林科技大学 旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵,712100)

摘要:为了定向育种获得蓝色百合，该研究以百合Robina为蓝色基因最佳受体，以其花丝诱导产生的胚性愈伤组织和再生小植株小鳞片作为转化材料，利用农杆菌介导法，将蝴蝶兰F3′5′H基因导入百合Robina中。结果表明：以小鳞片为转化材料，预培养 3 d，OD600为0.8，侵染10 min，共培养3 d，加入100 μmol/L AS稳定转化率最高为12.78%；而以胚性愈伤为转化材料，预培养2 d，OD600为0.8，侵染10 min，共培养3 d，加入100 μmol/L AS稳定转化率最高为12.22%。2种转化材料的最适潮霉素筛选浓度均为20 mg/L。对抗性植株分别进行PCR和反转录PCR检测,获得9个阳性株系，Southern印记分析进一步确定了6株转基因百合中携带蓝色基因F3′5′H，为后续进一步获得蓝色百合奠定了基础。

关键词:F3′5′H；Robina百合；胚性愈伤组织；小鳞片；遗传转化

OT杂种百合 Robina (Liliumtenuifoliumoriental×trumpet)是东方百合杂交系(oriental hybrids)与喇叭型百合杂交系(trumpet hybrids)的杂交种[1]。其茎秆粗壮，花大艳丽，香气浓郁，是百合中比较名贵的切花品种[2]。 百合Robina的花苞多为3～5个，花朵颜色为深粉红色，高度120～135 cm，生长周期100 d左右，喜欢排水性好的微酸性土壤，适宜温度15～28 ℃，需要经过低温春化过程后才能开花，无叶烧现象[3]。如果生长环境适宜， Robina百合的花朵直径可达18～20 cm，为百合中花比较大的品种之一。近年来，随着其在百合切花中所占的比重越来越大, 研究其花色具有重要的意义。

对于花卉的研究，花色改良一直是研究的热点，以前的研究中一般采用的是传统的育种方法，虽然也研究出许多新的花色，但是由于物种间存在种间隔离，传统育种技术很难打破种内基因资源的局限性[4]，所以大大制约了花色的创新。通过基因工程技术，可以克服传统育种方法的局限性，创造出更多的新花色[5]。

飞燕草素(delphinidin)是存在于植物中的一种花青素，它可以使植物呈现蓝紫色。而F3′5′H(类黄酮3′5′羟基化酶)是形成飞燕草素并决定花青素结构和花色的关键酶[6]。百合中由于缺乏F3′5′H基因而缺乏飞燕草素，所以自然界中没有紫色或蓝色的百合花[7]。本实验室前期通过对10个百合品种的比较分析，利用灰色关联分析理论确定适宜转蓝色基因的受体品种，确定花瓣中矢车菊色素含量少、黄酮醇含量高、液泡pH值高的OT杂种百合Robina为适宜转蓝色基因的受体品种[8]。前期实验室已经进行了携带F3′5′H基因表达载体的瞬时转化[7]，本研究主要是改良受体材料和实验方法，通过农杆菌介导法稳定转化Robina百合，并通过PCR等方法来检测，获得大量的百合转基因植株用于后续研究，为蓝色百合的获得奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

试验于2014年7月～2015年9月，在农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点开放实验室和旱区作物逆境生物学国家重点实验室完成。以购于云南花卉市场的Robina百合为试验材料，诱导花苞的花丝产生胚性愈伤，再生植株，花丝诱导培养基为MS+1.0 mg/L PIC(毒莠定)+30 g/L蔗糖+3.0 g/L植物凝胶。

试验中使用的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株是 LBA4404，导入的质粒是p1300-pPZP-F3′5′H-DFR， 质粒的T-DNA区段上携带CHS花特异启动子驱动的蝴蝶兰F3′5′H基因， E35S Pro(增强型CaMV35S启动子)驱动的风信子的DFR基因(蝴蝶兰F3′5′H基因表达的辅助基因)，以及潮霉素磷酸转移酶基因HPTⅡ(选择标记基因)，该载体由本实验室构建(图1)。

1.2方法

1.2.1胚性愈伤的悬浮培养取1.0 mg·L-1毒莠定诱导产生的胚性愈伤组织2.0 g(鲜重)切碎, 接种至 100 mL锥形瓶中，在瓶内加入40 mL 含与该胚性愈伤继代相同激素和蔗糖的液体培养基, 进行悬浮培养。然后将锥形瓶置于 (24±2)℃，100 r/min恒温摇床中，暗培养。前2次每3 d继代1次，其后每 7 d继代1次直到停止增长。继代时，要注意一定要静置至悬浮液中细胞团沉至锥形瓶底部后，倒去上部 1/2 旧的上清液，补充新鲜的培养液。每 6 d称量各瓶悬浮培养物的鲜重，测定每个悬浮系的增殖量，直至停止增长，获得悬浮培养物。

1.2.2农杆菌菌液的制备吸取甘油冻存的含有植物表达载体的农杆菌菌株100 μL 添加到含 50 mg·L-1kan和 25 mg·L-1Rif 的 25 mL 液体 YEB 培养基中, 28 ℃、180 r/min 摇菌 30 h左右。

CHS pro.花特异启动子；PhalaenopsisF3′5′H .蝴蝶兰类黄酮3’5’羟基化酶基因；NOS ter. NOS终止子；E35S pro. 增强型CaMV 35S启动子; Hyacinth DFR .风信子二氢黄酮醇4-还原酶基因；HPTⅡ.潮霉素磷酸转移酶基因图1　质粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR的T-DNA示意图CHS pro. Flower specific promoter; Phalaenopsis F3′5′H. Phalaenopsis flavonoid 3′5′ hydroxylase gene; NOS ter. NOS terminator; E35S pro. Enhanced CaMV 35S promoter; Hyacinth DFR.Hyacinth dihydroflavonol 4-reductase gene;HPTⅡ. Hygromycin phosphotransferase geneFig. 1　T-DNA schematic diagram of plasmid p1300-pPZP-F3′5′H-DFR

将摇好的菌液置于 50 mL离心管中,封口后再将离心管置于 4 ℃、5 000 r/min离心机中,离心 15 min，弃上清液，往下层沉淀中加入30 mL 重悬液(MS+10 mmol·L-1MES+1.0 mg·L-1PIC+30 g·L-1蔗糖)，重悬混匀后吸取 2 mL 用于菌液 OD600值测定，通过计算,向菌液中添加适量重悬液以调整其 OD600为 0.8。 最后在28 ℃、180 r/min 摇床中摇菌2～3 h, 摇完后以其作为浸染液。

1.2.3转化受体的预培养将悬浮培养后的胚性愈伤置于预培养基MS+1.0 mg·L-1PIC +30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝胶上;将大小一致的再生植株的小鳞片置于预培养基MS+1.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝胶上, 在(25±2) ℃黑暗条件下预培养, 预培养时间为0、1、2、3和 4 d。

1.2.4浸染及共培养用预先制备好的浸染液对经过预培养的2种转化受体进行浸染,侵染时间为 10 min，浸染后将转化受体置于共培养基上共培养, 共培养时间0、1、2、3、4和5 d。胚性愈伤的共培养基为MS+1.0 mg·L-1PIC +10 mmol·L-1MES+(0、50、100、150、200)μmol·L-1AS+ 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1植物凝胶; 再生小鳞片的共培养基为MS+1.5 mg/L NAA +10 mmol·L-1MES+( 0、50、100、150、200)μmol·L-1AS+ 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1植物凝胶。

1.2.5脱菌处理及筛选培养将共培养后的转化受体置于含 500 mg·L-1cef 的无菌水中脱菌处理 10 min，无菌水冲洗2～3 次后置于吸水纸上沥干，接于筛选培养基上。胚性愈伤筛选培养基为：MS+1.0 mg·L-1PIC+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝胶+200 mg·L-1carb+(0、5、10、15、20、25) mg·L-1hpt；再生小鳞片的筛选培养基为MS+1.5 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝胶+200 mg·L-1carb+(0、5、10、15、20、25) mg·L-1hpt，每隔2周在各自培养基上继代1次。

表1　用于本研究的引物

1.2.6植株再生筛选培养在25 ℃、16 h光照条件下进行，40 d后，转化受体即可在各自的筛选培养基分化出小苗。在筛选培养基中长出的小苗, 转接到生根培养基(1/2MS +0.5 mg·L-1IBA+0.1% AC+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝胶)。生根后的小苗继续培养, 使其生长更加强壮。

以上各个处理均取转化受体40～60个, 每个处理重复3次。每个处理在筛选培养3个月后进行统计，统计得到的潮霉素抗性苗数，计算稳定转化率(稳定转化率=潮霉素抗性苗数/转化受体数)。

1.2.7转化植株的PCR检测剪取抗性植株的细嫩叶片，采用 CTAB 法提取基因组 DNA。以提取的百合叶片的 DNA 为模板，根据载体中插入的F3′5′H、DFR和HPTⅡ 基因设计引物进行检测。其中F3′5′H扩增片段长度为1 550 bp，DFR扩增片段长度为1 110 bp，HPTⅡ扩增片段长度为554 bp。设计引物(见表1)。将质粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR作为阳性对照，非转基因植株的DNA作为阴性对照。反应体系选取25 μL体系，反应程序为：94 ℃预变性 3 min； 94 ℃变性30 s， 55 ℃退火45 s， 72 ℃延伸1 min，30个循环； 72 ℃再延伸2 min。进行琼脂糖凝胶电泳实验，得到PCR结果。

1.2.8转基因植株RT-PCR检测使用Omega试剂盒提取百合PCR阳性植株和未转化植株总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA的纯度及浓度检测。使用Preme Script RT reagent kit试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录合成cDNA链。以cDNA为模板对F3′5′H基因进行PCR扩增分析。

1.2.9转基因植株Southern印迹分析选取PCR检测为阳性的转基因抗性植株提取足量DNA，使用购买于罗氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 试剂盒进行Southern印迹分析。以质粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR为模板，使用HPTⅡ-F和HPTⅡ-R为引物，合成的片段进行回收制备探针。选取EcoRI酶切过夜，然后进行琼脂糖凝胶电泳，再经变性，中和后用高盐转移法将胶上的样品转移到尼龙膜上，进行杂交，洗膜，显影。

2结果与分析

2.1Robina百合遗传转化体系的优化

2.1.1预培养时间对转化效率的影响对百合的2种转化受体分别进行 0 ～ 4 d 预培养(图2)。结果表明不经预培养直接进行浸染的胚性愈伤和小鳞片都比较容易发生褐化(图版I ，a)，抗性芽诱导率很低。小鳞片预培养 3 d 时稳定转化率最高，为 12.78%；预培养 4 d 后抗性芽诱导率又开始下降。而胚性愈伤预培养2 d稳定转化率最高, 为12.22%。可见不经过预培养的百合胚性愈伤和小鳞片直接与菌液接触会伤害到细胞，不利于抗性芽的产生，但时间过长，细胞则转化不敏感，也不利于农杆菌侵染。

2.1.2共培养时间对转化效率的影响预培养完后, 对百合胚性愈伤和小鳞片进行共培养。由图3可以得出, 胚性愈伤和小鳞片都是共培养3 d稳定转化率最高, 分别是12.23%和11.94%。其中胚性愈伤共培养时间超过3 d转化率急速下降, 而小鳞片的转化率下降缓慢。共培养时间越长, 转化材料越不易脱菌, 所以转化率也会降低。

2.1.3AS浓度对转化效率的影响在侵染和共培养的过程中都需要加入一定量的AS, 加入AS有利于提高农杆菌Vir基因活性，Vir基因(virulence genes)决定了农杆菌侵染能力[9-10]，从而可以提高转化效率。由图4可以看出，AS为100 μmol/L时，两者转化率最高，胚性愈伤为11.67%，小鳞片为11.11% 。虽然愈伤组织和小鳞片的最适AS浓度相同，但是小鳞片在AS<100 μmol/L时，稳定转化率低于胚性愈伤，在AS>100 μmol/L时，稳定转化明显高于胚性愈伤。

2.1.4潮霉素浓度筛选在转化过程中选用潮霉素进行筛选实验，经过2个月的筛选，结果表明(表2)，当不加入潮霉素时，小鳞片和胚性愈伤的分化率分别是88.89%和91.33%，随着潮霉素浓度的的增加，分化率不断降低，当潮霉素浓度为20 mg·L-1时，外植体几乎全部褐化，所以小鳞片和胚性愈伤的潮霉素的筛选浓度确定为20 mg·L-1。

2.2转基因植株的再生

2种转化受体的获得(图版Ⅰ, b～i), 经过筛选培养45 d后,未转化的胚性愈伤和小鳞片逐渐褐化死亡, 而转化的会产生抗性芽(图版Ⅰ,j 和k)。产生的抗性芽长度长到3～5 cm时，切下进行再培养，使用高糖培养基可以使其生长更加强壮(图版Ⅰ,l)。抗性苗长大后,就可以进行检测和移栽。

2.3转化植株的PCR检测

获得187株百合潮霉素抗性苗，随机挑选生长强壮的小苗进行PCR检测，分别对F3′5′H、DFR和HPTⅡ基因进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳实验，最终有15株百合苗扩增得到目的条带，其中9株的PCR结果如下(图5),说明外源基因整合到百合苗中(图5)。

图2　预培养时间对百合胚性愈伤和小鳞片稳定转化率的影响Fig. 2　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different pre-culture time

图3　共培养时间对百合胚性愈伤和小鳞片稳定转化率的影响Fig. 3　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different co-culture time

图4　AS浓度对百合胚性愈伤和小鳞片稳定转化率的影响Fig. 4　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different acetosyringone concentration

2.4转化植株的RT-PCR检测

对PCR检测获得目的条带的15株百合苗再进行RT-PCR检测，最终有9株出现F3′5′H基因的目的条带(图6)，说明蓝色花基因F3′5′H在百合植株中进行了转录表达。

表2　百合再生小鳞片和胚性愈伤组织的潮霉素敏感性实验

注：表中数据代表3次重复试验的“平均值±标准误”；同列数据后标不同小写字母者表示在P=0.05水平差异显著。

Note：Data in the table are “average±standard error”of there repeat tests. Data in the same column with different lowercase letters have significant differences atP=0.05 level.

A. F3′5′H; B. DFR; C. HPTⅡ；M.Marker；P.质粒阳性对照；WT.未转化植株；1～9.转基因植株图5　百合潮霉素抗性植株的F3′5′H、DFR和HPTⅡ基因的PCR检测A. F3’5’H; B. DFR; C. HPTⅡ；M.Marker; P.Positive control; WT. Non-transformed; 1-9.Transformed plantletsFig. 5　PCR detection of transformed plantlets for presence of F3′5′H gene,DFR gene and HPTⅡ gene

2.5转化植株的Southern 印迹分析

为了再进一步检测目的基因是否转入到百合基因组中，对经过PCR和RT-PCR的植株再进行Southern印迹分析。结果表明(图7)，有6株出现杂交带，分别为植株1、2、3、4、5、9，其中植株1、2、3、4、5为单一杂交带，说明其为潮霉素磷酸转移酶基因的单拷贝；植株9有2条杂交带，说明其为潮霉素磷酸转移酶基因的2个拷贝，植株6、7、8和对照未出现杂交信号，说明潮霉素磷酸转移酶基因没有转入到百合基因组中。

3讨论

农杆菌介导法是现代百合转基因研究中常用的方法[11]，自1992年Cohen等[12]首次通过农杆菌介导法获得转基因百合以来，百合转基因的研究取得了非常大的进步。其中转化材料对转化结果有很大的影响[11]，愈伤组织和小鳞茎是最常用的转化材料。张杰等[13]使用不同浓度配比的激素NAA和6-BA，对LA系列百合Eyeliner 的花器官进行诱导，诱导出愈伤组织和不定芽。本实验室[1-2]发现使用不同浓度的PIC 激素对OT系列百合Robina花器官进行诱导，也可以诱导出愈伤组织和不定芽。本研究中使用1.0 mg·L-1PIC诱导花丝同时获得了胚性愈伤和小植株。

M.Marker；P.质粒阳性对照；WT.未转化植株；1～15.转基因植株图6　百合潮霉素抗性植株的F3′5′H基因的RT-PCR检测M.Marker; P. Positive control; WT. Non-transformed; 1-15.Transformed plantletsFig. 6　RT-PCR detection of transformed plantletsfor presence of F3′5′H gene

N. 未转化植株(对照)；1～9.RT- PCR阳性潮霉素抗性植株图7　潮霉素抗性植株的Southern blot印记分析N. Non-transformed plants(comparison); 1-9. RT- PCR positive transgenic plantsFig. 7　Southern blot analysis of putative transgenic lines

胚性愈伤组织作为转基因受体材料具有很多的优点，例如繁殖速度比较快速，稳定转化的效率比较高，嵌合体比较少[14]。2003年时Mercuri A等[15]就利用胚性愈伤组织作为转化受体，成功转化了百合。本研究中对胚性愈伤组织进行了悬浮培养[16-17]，前期权永辉[2]对Robina百合悬浮培养技术进行了研究，本研究在其基础上进行优化，加入30 mg·L-1柠檬酸降低百合褐化率，成功获得Robina百合的悬浮系，用作百合转基因的受体材料。

使用小鳞片作为百合转化的受体材料的研究有很多，因为用小鳞片不定芽分化率高，在器官发生过程中不易形成嵌合体[18]。例如，2012年袁霖等[19]使用东方百合索邦的鳞片成功转化了花青素合成调节基因Rosea1；2014年李云华等[20]使用新铁炮百合鳞片成功转化了LfMADS1基因；2014年张焕等[21]使用亚洲百合鳞片成功转化了GsZFP1基因。本研究使用的是再生植株的小鳞片，转化时污染率低, 可以提高转化的成功率。同时本研究发现在Robina百合中, 只使用NAA一种激素即可使小鳞片再生出小苗，节约了研究的成本。

在本研究中同时使用了2种转化材料，都获得了百合抗性植株，经过PCR、RT-PCR以及Southern印记分析最终得到了6株携带蓝色基因F3′5′H的转基因百合，为后续获得蓝色的百合花提供了技术支持和物质基础。

参考文献:

[1]QI Y Y, DU L J, QUAN Y H,etal.Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cell suspension cultures and plant regeneration inLiliumtenuifoliumoriental×trumpet ‘Robina’ [J].ActaPhysiol.Plant. 2014,36(8):2 047-2 057.

[2]权永辉. 百合体细胞胚的诱导及悬浮培养的研究[D]. 陕西杨凌：西北农林科技大学，2013.

[3]张施君，周厚高，潘文华，等.麝香百合的抗热生理指标初探[J]. 中国农学通报，2005, 21(3): 240-242.

ZHANG S J, ZHOU H G,etal. Preliminary studies on the physiology of heat tolerance inLiliumlongiflorum[J]．ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2005, 21(3): 240-242.

[4]孟丽. 蓝色花形成关键基因的分离及其表达分析[D]. 北京：北京林业大学, 2006.

[5]FILIPPA BRUGLIERA, TAO G Q, URSULA TEMS,etal. Violet/blue chrysanthemums-metabolic engineering of the anthocyanin biosynthetic pathway results in novel petal colors [J].PlantCellPhysiol. 2013,54(10):1 696-1 710.

[6]TANAK Y, BRUGLIERA F. Flower colour[C]. //Ainsworth, Blackwell, Flowering and its manipulation. Oxford. 2006：201-239.

[7]祁银燕. 两种单子叶植物蓝色花相关基因的功能验证[D]. 陕西杨陵：西北农林科技大学，2013.

[8]张萍，刘雅莉，祁银燕，等.利用灰色关联分析法选择适宜转蓝色基因的百合品种[J]. 中国农学通报，2010,26(20):52-56.

ZHANG P, LIU Y L, QI Y Y,etal.The Selection of lily cultivars suitable for being transformed blue genes by using the grey correlation analysis[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2010, 26(20):52-56.

[9]邹智。农杆菌Vir基因诱导因子研究进展[J]. 中国生物工程杂志，2011，31( 7): 126-132.

ZOU Z. Advances on factors influencing induction ofAgrobacteriumtumefaciensvirulence genes [J].ChinaBiotechnology，2011，31(7): 126-132.

[10]LEO S. MELCHERS, DAVE V. THOMPSON, KEN B. IDER,etal.Molecular characterization of the virulence gene virA of theAgrobacteriumtumefaciens octopine Ti plasmid[J].PlantMolecularBiology, 1988，11(2): 227-237.

[11]LIU X H, GU J H, JWANG J M,etal. Lily breeding by using molecular tools and transformation systems[J].MolecularBiologyReports, 2014, 41(10):6 899-6 908.

[12]COHEN A，CAROLE A，MEREDITH P.Agrobacterium-mediated transformation ofLilium[J].ActaHorticulturae, 1992, 325(86): 611-618.

[13]张杰，李洋，孙红梅.LA系列百合花器官组培快繁技术研究[J]. 西北植物学报，2014,34(9):1 894-1 899.

ZHANG J, LI Y, SUN H M. Floral organs tissue culture propagation technology ofLiliumlongiflorum×L.asiaticHybrid‘Eyeliner’ [J].ActaBot．Boreal．-Occident．Sin., 2014,34(9):1 894-1 899.

[14]王丽娜，廖卉荣，杨素丽，等.百合遗传转化体系研究进展[J]. 贵州农业科学，2008，36(1)：127-133.

WANG L N, LIAO H R, YANG S L,etal. Research progress on genetic transformation system in lily [J].GuizhouAgriculturalSciences, 2008, 36(1):127-133.

[15]MERCURI A, DE BENEDETTI L, BRUNA S,etal.Agrobacterium-Mediated transformation with Rol genes ofLiliumlongiflorumThunb[C]//XXI International eucarpia symposium on classical versus molecular breeding of ornamentals-Part I. [S.1]:[s.n.].2003:129-136.

[16]PS CHOUREY,DB ZURAWSKI. Callus formation from protoplasts of a maize cell culture[J].Theor.Appl.Genet, 1981, 59(2): 341-344.

[17]A TRIBULATO, P C REMOTTI, LOFFLER H J M. Occurrence of embryo-like structures and plant regeneration from a cell suspension ofLliliumlongiflorum[J].ActaHortic., 1997,447(1): 205-206.

[18]狄翠霞，张满效，谢忠奎，等.合组织培养和遗传转化的研究进展[J]. 西北植物学报，2006，26(4)：858-863.

DI C X, ZHANG M X, XIE Z K,etal. Research advances in lily tissue culture and genetic transformation [J].ActaBot．Boreal．-Occident．Sin, 2006, 26(4): 858-863.

[19]袁霖，魏迟，贾桂霞.花青素合成调节基因Rosea1转化东方百合索邦的研究[J]. 广东农业科学, 2012, 10(3): 10-22.

YUAN L, WEI C, JIA G X. Study on transformotion ofLiliumorentialSorbonne with an anthocyanin regulatory geneRosea1[J].GuangdongAgriculturalSciences,2012, 10(3): 10-22.

[20]李云华，刘青，刘青林.LfMADS1基因对新铁炮百合‘Raizen No.1’的遗传转化[J]. 生物技术通报，2014,26(3)：86-93.

LI Y H, LIU Q, LIU Q L. Study on genetic transformation ofLfMADS1 gene intoLilium×formosanum‘Raizen No.1’ [J].BiotechnologyBulletin, 2014, 26(3): 86-93.

[21]张焕，郑佳，等.农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转GsZFP1基因研究[J]. 生物技术通报, 2014, 26(2): 91-96.

ZHANG H, ZHENG J,etal. Stablishment ofAgrobacterium-mediated Asiatic Lily‘Cedeazzle’ transformation system and transfer ofGsZFP1 genes [J].BiotechnologyBulletin, 2014, 26(2): 91-96.

图版Ⅰ　百合胚性愈伤和小鳞片的产生及其转化成苗过程a.预培养褐化的外植体；b.花丝产生胚性愈伤；c.胚性愈伤组织；d.百合悬浮培养系；e.胚性愈伤的共培养；f .花丝诱导产生的芽；g.百合小芽；h.长大的百合苗；i.小鳞茎的共培养；j.胚性愈伤产生的抗性芽；k.小鳞片产生的抗性芽；l.抗性植株Plate Ⅰ　Production of lily embryonic callus and bulb scales and the transformation into seedlinga. Pre-cultured explants browning; b.Filaments produce embryogenic callus; c. Embryogenic callus; d.Suspension culture system of Lily; e.Co-culture of embryogenic callus; f.Filaments induced bud; g .Lily bud; h. Growing lily seedlings; i. Co-culture of small bulbs; j.Resistant buds produced from embryogenic callus; k. Resistant bud produced by bulb scale; l.Resistant plants

(编辑:宋亚珍)

Genetic Transformation of thePhalaenopsisF3′5′Hto OT Lily Robina

LIU Ailing, LIU Yali*, LOU Qian, ZHANG Haiqin

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, College of forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Abstract:To obtain bluish Lilium spp. in direct breeding, we screened the suitable variety-OT lily Robina for genetic transformation. Here, both embryonic callus induced from filament and regenerated bulb scales of OT lily Robina were used as the transformation material. Agrobacterium-mediated transformation of Phalaenopsis F3′5′H was studied. The results showed：with the pre-culture 3 d, OD600=0.8, infection time 10 min, co-cultured for 3 d, 100 μmol/L acetosyringone conditions, the stable transformation rate of regenerated bulb scales could reach to the highest 12.78%; however, embryogenic callus pre-culture 2 d, OD600= 0.8, infection time 10 min, co-cultured 3 d, with 100 μmol/L acetosyringone conditions, which the stable transformation rate was the highest 12.22%. In all the conditions, the best hygromycin-resistant screening concentrations always was 20 mg/L. PCR and reverse transcription PCR assay showed 9 putative transgenic plants were obtained. Southern hybridization analysisfurther proved 6 plants that the transgenic lilium flowers carry blue gene F3′5′H. The results provided technical support and material basis for the continuing development of novel bluish Lilium flowers.

Key words:F3′5′H；lily Robina; embryonic callus; bulb scales; genetic transformation

文章编号:1000-4025(2016)05-0874-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0874

收稿日期:2016-01-31;修改稿收到日期:2016-04-26

基金项目:国家自然科学基金(31471905)

作者简介:刘爱玲(1988-)，女，在读硕士研究生，主要从事园林分子植物育种方面的研究。E-mail：1032239251@qq.com *通信作者:刘雅莉，硕士，教授，博士生导师，主要从事园林遗传育种方面的研究。E-mail：lyl6151@126.com

中图分类号:Q785;Q789

文献标志码:A