一个水稻半矮化和花发育异常突变体的遗传分析和分子定位

初志战 ,谢勇尧 , 胡　琛, 郭海滨, 刘耀光*

(1 华南农业大学 生命科学学院，亚热带农业生物资源保护与利用重点实验室,广州 510642;2 华南农业大学 食品学院，广州 510642；3 华南农业大学 公共基础课实验教学中心, 广州 510642)

一个水稻半矮化和花发育异常突变体的遗传分析和分子定位

初志战1,谢勇尧1, 胡琛2, 郭海滨3, 刘耀光1*

(1 华南农业大学 生命科学学院，亚热带农业生物资源保护与利用重点实验室,广州 510642;2 华南农业大学 食品学院，广州 510642；3 华南农业大学 公共基础课实验教学中心, 广州 510642)

摘要:从粳稻品种‘日本晴’经60Co诱变的M2代材料中发现一个半矮化并且花发育异常突变体sd-df3，其表现为植株半矮化，分蘖增加，半包茎穗，雄蕊发育不良，无花粉。遗传分析显示，该突变体表型受1对隐性核基因控制。以杂合型突变体为母本，与广亲和品种Dular杂交，构建F2分离群体，将该基因定位在水稻第3号染色体，In/Del标记333591与333818之间的物理距离约为227 kb的范围，目前该范围内没有矮化相关基因报道。

关键词:水稻；半矮化并花发育异常；基因定位；遗传分析

株高是水稻最重要的农艺性状之一，它直接影响到水稻的高产与稳产。由于矮秆作物通常表现出抗倒伏、叶挺、穗多、增产明显等优点，因此日本在20世纪30年代末就开始粳稻品种的矮化育种研究。20世纪50年代末60年代初，半矮生基因sd1的发现，促成了综合性状好的抗倒伏品种的培育，使水稻单产提高20%～30%，引发了全球水稻生产第一次绿色革命[1]。

根据水稻的矮化效应，可以将矮化分为：矮化、半矮化和极矮化3大类。Takahashi等[2]和Takeda[3]根据水稻各节间的分布将水稻矮秆突变体分成dn、dm、sh、d6和nl型等5种类型。

引起植物矮化的因素主要有两方面，生长环境是一个重要的外在因素，矮化主效基因则是决定植株高矮的主要内在因素。目前已发现鉴定近90个水稻矮化、半矮化突变体，现已克隆的水稻矮化基因有D1[4]、D2[5]、D3[6]、D10[7]、D11[8]、D14/D88[9]、D17[10]、D18[11]、D35[12]、D61[13]、GID1[14]、GID2[15]、BRD1[16]、SD1[17-19]和OSH15[20]。众多研究表明，许多矮化基因参与到了植物激素尤其是赤霉素(GA)和油菜素类固醇(BR)的生物合成与信号转导，如D18[11]和D35[12]参与GA的合成；SD1[17-19]参与GA的信号转导，D2[5]和D11[8]参与了BR的合成，而D61[13]则通过影响BR的信号转导导致表型的产生。D3[6]、D10[7]、D14/D88[9]、D17[10]则参与到独脚金内酯(SLs，strigolactones)的合成与传导途径。独脚金内酯是一种新的植物激素，于2008年被发现，具有抑制腋芽过度伸长的功能[21]。

尽管众多的矮化材料被研究，甚至不少基因已经被克隆，但是只有sd1(d-47)在育种中得到广泛应用，但是sd1单一资源的应用，存在严重的遗传脆弱性。因此发掘、克隆和利用新的矮化基因，不仅对研究矮化作用机理有重要理论意义，对实现水稻株高的定向改良，实现水稻稳产增产也具有重要的应用价值。

花器官发育是开花植物繁衍的基础，近30年来，花发育的相关研究取得了迅猛的发展，尤其在拟南芥和金鱼草的研究中，大量的MADS-box基因的成功分离为花发育的分子生物学领域研究的一个重大突破。目前水稻中也发现有5类MADS-box基因参与了花器官的形成，水稻花器官的发育模型已从最初的“ABC”模型发展到“ABCDE”，并且还在不断补充和完善[22]。

本实验室利用60Co诱变‘日本晴’，M2代获得一个水稻半矮化并花发育异常突变体。突变体主要表现为各节间缩短，多分蘖，叶片直立，穗大部分包被于剑叶的叶鞘中，少部分露出叶鞘外，包被于叶鞘内的小穗不结实。该突变体与ddf1[23]和ddf2[24]表现相似，但为半矮化，因此将突变体暂命名为sd-df3(semi-dwarfanddeformedflower3)。遗传分析表明，该性状是由1对隐性基因控制的。本研究对该突变体进行形态特征分析，并对该突变基因进行了定位，以期为该基因的克隆与应用提供参考。

1材料和方法

1.1突变体材料

60Co诱变‘日本晴’获得稳定遗传的sd-df3突变体，秧苗按照行距25 cm，株距15 cm插植。插秧后从第3周开始每周对株高、分蘖数进行测量统计。齐穗后，剥去‘日本晴’和sd-df3主茎叶鞘后逐一测定各节节间长。

1.2方法

1.2.1定位群体的构建由于sd-df3 突变体小穂不结实，因此不能直接用于杂交，获得定位群体。因此定位群体的母本选用可分离出半矮化材料的M1群体中的正常植株，父本采用籼稻Dular，杂交后获得F1种子。播种F1后，自交繁殖获得F2种子，单株收种。分株系种植F2代，以能分离出半矮化苗的F2群体为定位群体。

1.2.2基因定位基因初步定位：采用SDS法[25]提取28株半矮化植株叶片总DNA用于基因定位。基因进一步定位：根据初步定位结果，采用快速打叶法[26]对635株定位群体植株进行两侧标记检测，并利用内部In/Del引物进一步缩小定位区间。

本研究用于基因定位的分子标记为In/Del标记：一部分为本实验室已有的，另一部分为根据已公布的水稻品种‘93-11’和‘日本晴’全基因组序列自行开发。这些标记均匀分布于水稻12条染色体，共147对。

2结果与分析

2.1突变体表型及农艺性状鉴定

由图1可以看出，与野生型相比，突变体sd-df3在拔节期就表现出明显的矮化表型，叶片短而窄，随着生育期的推移，表型愈发明显。抽穗期，突变体sd-df3株高仅为野生型的58.6%。通过节间长度调查发现，sd-df3穗下第1、2、3、4节的节间长度均缩短，分别是野生型的40.7%、51.7%、50.8%和49.1%，可以发现，各节间缩短幅度差别不大。根据节间长度缩短特点，可以将突变体sd-df3划为dn类。除了半矮化性状外，突变体sd-df3还表现小穂不结实，无花粉型(图2)。

A. 成熟期野生型和突变体的植株形态； B～D. 野生型与突变体节间长度、分蘖数及株高的统计分析：Ⅰ～Ⅳ．穗下第1节至第4节；**表示该性状在0.01水平上差异极显著图1　水稻日本晴野生型和sd-df3的形态学比较特征A. Plant phenotypes of wild type and sd-df3；B-D. The comparison of internodes length, plant height and number of tillers between wild type and sd-df3 ：Ⅰ-Ⅳ. The upper four internodes down panicle； ** indicate a statistically significant difference (P<0.01)Fig. 1　Comparison of morphological characters between Nipponbare and sd-df3

A. 小穗去除内外稃后的表型； B. 雄蕊经I2-KI染色后表型图2　野生型(WT)和sd-df3突变体(MT)小穗形态分析The spikelets removed lemma and palea； B. The stamen stained with I2-KIFig. 2　Phenotypes of spikelet in sd-df3 mutant (MT) and wild type (WT)

2.2突变体的遗传分析及定位结果

选取在两亲本间有多态性的In/Del标记，共有147个，均匀分布于水稻12条染色体上。用28株突变植株进行初定位，将突变基因初步定位在第3号染色体的短臂上， In/Del分子标记 333050与334307之间，物理距离约为1 257 kb的范围。

表1　F2群体株高性状分离调查

表2　用于精细定位的新In/Del标记

为了进一步缩小定位区间，选取了F2群体中635株半矮化突变植株做为精细定位群体。根据公布的粳稻‘日本晴’与籼稻‘93-11’序列，在In/Del标记333050与334307之间，目前只找到了4对在2个亲本有差异的新标记(表2)，并最终将突变基因sd-df3定位在In/Del标记333591与333818之间，物理距离约为227 kb的范围(图3)。

3. 讨论

水稻是世界上最重要的粮食作物之一, 半矮生基因sd1的发现促成了综合性状好的、抗倒水稻品种的产生,使水稻产量实现了巨大突破。对中国南方稻区育成的313个籼稻品种的系谱分析表明，约75.6%具有sd1矮源血统，而粳稻品种矮生性主要来源于‘农垦58’和Balila，因此矮化基因单一，存在风险[27]。

图3　sd-df3在水稻第3号染色体的定位Fig. 3　Location of sd-df3 on rice chromosome 3

本研究通过物理方法诱变获得一个半矮化突变体，从拔节期开始突变体就呈现明显的矮化特点，分蘖增多，叶片直立，穗大部分包被于剑叶的叶鞘中，并且雄蕊发育异常，无花粉，小穗不结实。由于独脚金内酯具有抑制腋芽过度伸长的功能，因此该激素导致的水稻矮化往往与分蘖增多相关联[6-9,28]。矮化引起小穗育性下降甚至不育，部分由于矮化植株营养器官如根、茎、叶等显著减小，生长弱势造成，部分由于矮化基因引起了赤霉素的表达和信号转导发生障碍[29-30]，也有部分是由于某个矮化基因同时直接控制水稻茎/叶和花器官的发育，即具有“一因多效”的遗传性状表现,如ddf1[23]、ddf2[24]和dtl1[31]。本研究sd-df3突变体矮化与雄性不育共遗传，遗传分析表明该性状受单隐性基因调控，通过图位克隆将该矮化基因定位于第3号染色体，In/Del标记333591与333818之间，物理距离约为227 kb范围。目前定位于3号染色体的矮化、半矮化基因有ipd1、dlt2、d88/d14/htd2、OsTB1/fc1、OSDWARF4、Brd1、d162(t)和ssd1共8个，但它们均与sd-df3位置相差较远，更非等位基因。目前已报道的，在第3染色体控制花药发育的基因有PAIR1[32]、MEL1[33]、OsAM1[34]、OsSDS[35]、CYP704B2[36]和DPW[37],它们和sd-df3也非等位基因，表型也不同，而ddf1和ddf2分别位于第6和第11染色体，因此可以确认sd-df3为一个新的调控水稻矮化并花发育的基因。由于Dular和‘日本晴’在In/Del标记333591与333818之间难以找到新的标记，因此准备以‘黄华占’和‘93-11’为新的父本，构建新的精细定位群体。

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(编辑:宋亚珍)

Genetic Analysis and Gene Mapping of a Semi-dwarf and Deformed Flower Mutant in Rice

CHU Zhizhan1, XIE Yongyao1, HU Chen2, GUO Haibin3, LIU Yaoguang1*

(1 College of Life Sciences, South China Agricultural University, State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Guangzhou 510642， China;2 College of Food Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642， China;3 Center of Experimental Teaching for Common Basic Course, South China Agricultural University, Guangzhou 510642， China)

Abstract:A rice semi-dwarf and deformed flower mutant, temporarily named as sd-df3, was identified from60Co γ-ray radiation mutation in japonica rice variety Nipponbare. The mutant was characterized by semi-dwarf, more tillers, semi-enclosed panicle, stamens dysplasia and non-pollen. Genetics analysis indicated that the mutant was controlled by a single recessive gene. The F2 mapping population was derived from a cross between the heterozygous sd-df3 genotype and a wide compatible variety Dular. The gene was located in a 227 kb region between the In/Del marker 333591 and 333818 on chromosome 3 in rice, which was assumed to be a new gene controlling semi-dwarf and deformed flower.

Key words:rice; semi-dwarf and deformed flower; gene mapping; genetics analysis

文章编号:1000-4025(2016)05-0910-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0910

收稿日期:2016-02-19;修改稿收到日期:2016-04-20

基金项目:亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室开放课题(SKL-CUSAb-2013-04)；江西省教育厅科技计划(GJJ14707)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310485)

作者简介:初志战(1977-)，博士，讲师，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail: chuben@scau.edu.cn; *通信作者:刘耀光，研究员，博士生导师，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail: ygliu@scau.edu.cn

中图分类号:Q754;Q789

文献标志码:A