地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

赵　乐，史晶晶，马利刚，何庆祥，冯卫生，郑晓珂，朱畇昊*

(1 河南中医学院 药学院，郑州 450046；2 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，郑州 450046)

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

赵乐1,2，史晶晶1,2，马利刚1,2，何庆祥1，冯卫生1,2，郑晓珂1,2，朱畇昊1,2*

(1 河南中医学院 药学院，郑州 450046；2 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，郑州 450046)

摘要:以地黄为材料，通过分析地黄转录组数据，设计特异性引物，克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)基因的cDNA序列，命名为RgGGPPS1，GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上，进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：(1)RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp，编码328个氨基酸。(2)生物信息学分析结果显示，RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD)，与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。(3)利用构建的原核表达载体pET-32a-RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白，采用Ni2+亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。(4)荧光定量PCR结果显示，RgGGPPS1基因在根中表达量最高，叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。

关键词:地黄；RgGGPPS1基因；生物信息学分析；原核表达；表达分析

地黄(RehmanniaglutinosaLibosch)是玄参科地黄属多年生草本植物，以其块根入药，是中国传统的常用中药材，广泛分布于河南、山西、山东和陕西等地，其中以河南古怀庆府地区(即温县、博爱、泌阳、孟县)为地黄的道地产区，该地区所产地黄称为“怀地黄”，是著名的“四大怀药”之一[1]。地黄的块根中含有环烯醚萜、苯乙醇、三萜、黄酮、木脂素及多糖等化合物，其中以环烯醚萜及其苷类为主[2]。地黄药理活性显著，对神经系统、免疫系统、心脑血管系统等方面均有一定作用，关于地黄药效物质基础的研究主要集中在环烯醚萜类成分，具有神经保护、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等多种生物学活性[3]。

地黄的研究多集中在化学成分、药理学和栽培学等方面，且已有良好的研究基础，但关于地黄次生代谢产物生物合成途径方面的研究较少，Sun等[4]利用转录组分析研究了可能参与地黄梓醇生物合成的基因。目前已见报道地黄基因克隆有病程相关蛋白RgPR-10基因[5]、Ca2+-ATPase基因[6]等，地黄次生代谢产物生物合成途径中关键基因的克隆报道较少。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)催化法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)和异戊烯基焦磷酸(isopentenyl phrophosphate，IPP)反应，生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)，GGPP为赤霉素、二萜、类胡萝卜素和叶绿素等物质的合成提供了前体物，是二萜类化合物的共同前体[7]。因此GGPPS是植物次生代谢的关键酶之一，目前，已从多种植物中克隆得到GGPPS基因并进行了功能分析，如拟南芥[8]、番茄[9]、丹参[10]、烟草[11]、银杏[12]、西瓜[13]、雷公藤[14]等，关于地黄GGPPS基因的克隆则未见报道。

通过分析本实验室前期获得的地黄转录组数据，有一条在KEGG代谢通路中注释为GGPPS的基因序列，设计特异性引物，扩增得到地黄GGPPS基因的cDNA序列，命名为RgGGPPS1，在生物信息学分析的基础，进行原核表达、纯化和组织特异性表达分析，这将为今后研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。

1材料和方法

1.1材料

地黄(R.glutinosa)栽培品种‘北京3号’和野生种均种植于河南中医学院河南中药植物园，在地黄成熟期(10月28日)，采集栽培品种和野生种的根、茎和叶片，样品采集后经液氮冷冻，保存于-80 ℃冰箱中，备用。

1.2方法

1.2.1RNA提取与反转录使用植物RNA提取试剂盒(康为世纪公司)提取地黄根、茎和叶片总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，用NanoDrop 2 000测定总RNA浓度和纯度。根据反转录试剂盒(北京全式金公司)说明书，以得到的地黄各组织的总RNA为模板，oligo(dT)20为引物，反转录合成得到地黄各组织的cDNA。

1.2.2RgGGPPS1基因克隆根据实验室前期获得的地黄转录组数据中GGPPS基因的序列信息，用Primer 5软件设计地黄GGPPS基因的特异性引物，正向引物RgGGPPS1-F(5’-TGCGAAATCAAGAACATAACC-3’)和反向引物RgGGPPS1-R(5’-TGCTCCGCCATAGCGAATAG-3’)，以地黄‘北京3号’根cDNA为模板，扩增RgGGPPS1基因的cDNA序列，PCR程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环；72 ℃延伸8 min，回收与预期大小一致的条带，将其连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞(北京全式金公司)，经菌落PCR检测后挑选阳性克隆进行测序。

1.2.3RgGGPPS1基因的生物信息学分析将测序得到的序列提交到NCBI ORF Finder 查找开放阅读框，并通过Blastp与nr 数据库进行序列比对分析。RgGGPPS1基因编码蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam；使用InterPro Scan预测蛋白的保守结构域；采用SWISS-MODEL进行蛋白质的三维同源建模；使用SignalP 4.0 Server进行信号肽的预测；利用Target P 1.1 Server预测蛋白亚细胞定位；跨膜区预测通过TMHMM Server v.2.0预测；使用MEGA5软件相邻连接法(neighbor-joining)构建系统进化树，bootstrap检验的重复次数为1 000次。

1.2.4RgGGPPS1基因原核表达载体的构建与诱导表达根据RgGGPPS1基因的测序结果，设计1对RgGGPPS1基因的原核表达引物，正向引物RgGGPPS1-Exp-F(5’-CGGAATTCATGATTTTCTCAACAG-3’，下划线部分为EcoR I酶切位点)和反向引物RgGGPPS1-Exp-R(5’-CCGCTCGAGTCAAACTGGTGCGGCA-3’，下划线部分为XhoI酶切位点)，以测序正确的pMD19-T-RgGGPPS1质粒为模板，用Primer STAR HSTaq(Takara公司)扩增RgGGPPS1基因的ORF序列，PCR程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA产物纯化试剂盒(天根公司)回收纯化目的基因条带，然后用EcoR I和XhoI对纯化的PCR产物和原核表达载体pET-32a分别进行双酶切，回收目的基因片段和载体片段，T4DNA Ligase 16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(北京全式金公司)，挑单克隆提取质粒经双酶切鉴定后，酶切鉴定正确的质粒送北京三博公司测序。

将测序正确的单克隆接种到LB液体培养基中(含氨苄青霉素)过夜培养，第二天按照1:100比例接种到LB液体培养基中(含氨苄青霉素)，振荡培养至对数生长期(OD600至0.6)，然后在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃、150 r/min条件下培养8 h，诱导地黄RgGGPPS1重组蛋白的表达，诱导完成后，用SDS-PAGE(5%浓缩胶和12%分离胶)检测重组蛋白的表达。

1.2.5RgGGPPS1重组蛋白的纯化根据RgGGPPS1重组蛋白的诱导表达条件，扩大培养体积，诱导完成后，在10 000 g、4 ℃离心收集菌体，用PBS (pH7.3)重悬菌体后，超声破碎大肠杆菌细胞。大肠杆菌裂解液在12 000 g、4 ℃离心20 min，收集上清，经0.45 μm滤器过滤后，按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(康为世纪公司)说明书纯化RgGGPPS1重组蛋白，用SDS-PAGE检测不同咪唑浓度洗脱的目的蛋白，确定最佳洗脱浓度，洗脱的目的蛋白经透析和超滤后，用Bradford法测定蛋白含量。

1.2.6RgGGPPS1基因表达模式分析地黄各组织的cDNA稀释50倍作为荧光定量PCR反应模板，以RgTIP41基因[15]为内参，GenBank登录号为KT306007(正向引物5’-ATTGGGTAGATTGCCAGGAG-3’；反向引物5’-CCATTGTCAGCCAATTCATC-3’)，检测RgGGPPS1基因在地黄栽培品种‘北京3号’和野生种各组织的表达量，RgGGPPS1基因RT-PCR正向引物(5’-CCCATCTAGAAGAGGCAAGC-3’)，反向引物(5’-GAACAATGCGTCTCCTGCTA-3’)，每个样品重复3次，RT-PCR反应体系为：10 μL 2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)、正反向引物各0.4 μL、cDNA 模板2 μL、加ddH2O 至20 μL，反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，根据溶解曲线判断RT-PCR产物的特异性，相对定量分析采用2-ΔΔCt方法[16]，所得实验数据用统计分析软件SPSS 13.0进行单因素方差分析，以地黄野生种根的Ct值的平均数设为l，进行RgGGPPS1基因表达模式分析。

2结果与分析

2.1RgGGPPS1基因的克隆

通过分析本实验室获得的地黄转录组数据，有1条注释为GGPPS的转录本，长度为1 323 bp，将序列信息提交到NCBI ORF Finder发现其包含1个完整的开放阅读框(ORF)，根据该基因的序列信息，设计1对特异性引物，以地黄‘北京3号’根的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物约为1 100 bp，电泳结果如图1所示，测序后得到地黄RgGGPPS1基因完整的ORF序列，大小为987 bp，编码328个氨基酸，RgGGPPS1基因的序列信息已经提交到NCBI GenBank，登录号为KU258808。

2.2RgGGPPS1基因编码蛋白的生物信息学分析

由ExPASy Server提供的ProtParam tool预测地黄RgGGPPS1蛋白的分子量35.90 kD，等电点是5.77，RgGGPPS1基因cDNA的核苷酸序列及对应氨基酸序列如图2所示。

M. DL2 000；1. RgGGPPS1图1　PCR扩增RgGGPPS1基因Fig. 1　PCR amplification of RgGGPPS1 gene

用InterProScan预测RgGGPPS1蛋白的保守结构域：多聚异戊烯基合成相关酶(IPR017446)、多聚异戊烯基合成酶(IPR000092)、异戊二烯合成酶结构域(isoprenoid synthase domain)(IPR008949)，说明RgGGPPS1蛋白属于多聚异戊烯基合成酶家族的成员。

根据SignalP预测RgGGPPS1蛋白不含信号肽，TargetP预测结果显示该蛋白可能位于叶绿体中，用TMHMM预测该蛋白的跨膜区，结果显示RgGGPPS1蛋白不含跨膜区。

用SWISS-MODEL在线服务器预测RgGGPPS1蛋白的三维结构，以拟南芥位于叶绿体的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶11(PDB ID：5e8l)的晶体结构为模板，在第38～320位氨基酸残基建模，序列的一致性为45.71%，三维模型覆盖率为85%，根据预测结果RgGGPPS1蛋白可能以同源二聚体的形式发挥作用。

2.3多序列比对及系统进化分析

Blast比对结果显示，RgGGPPS1蛋白与芝麻(Sesamumindicum，SiGGPPS，XP_011092951.1)、丹参(Salviamiltiorrhiza，SmGGPPS，AEZ55680.1)、番茄(Solanumpennellii，SpGGPPS，XP_015087865.1)、烟草(Nicotianatabacum，NtGGPPS，AIC77784.1)、三七(Panaxnotoginseng，PnGGPPS，AIZ00598.1)和拟南芥(Arabidopsisthaliana，AtGGPPS，AAA81879.1)等植物的GGPPS蛋白序列一致性较高，分别为92%、87%、77%、79%、76%和65%。用DNAMAN软件对这7种植物GGPPS蛋白氨基酸序列进行多序列比对，结果(图3)显示，GGPPS蛋白N端变异较大，多肽链中部和C端保守性较强，有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD)，在地黄RgGGPPS1蛋白的氨基酸序列中也有这2个保守基序，分别是DDLPCMDD和DDILE(图3)。

植物、动物和微生物中都普遍存在GGPPS蛋白，从NCBI blastp的比对结果中，选取不同物种来源的共26条GGPPS蛋白序列作为参考，构建系统进化树。从结果(图4)中可以看出，不同物种来源的GGPPS蛋白在进化上归属不同的分支，分别聚为动物、真菌、细菌、植物四大类，RgGGPPS1蛋白属于植物分支中的双子叶植物，与芝麻亲缘关系较近。

终止密码子用*标记，左侧数字表示核苷酸位置，右侧数字表示氨基酸位置，小写斜体为RgGGPPS1基因的克隆引物序列图2　RgGGPPS1基因的cDNA序列及对应的氨基酸序列The marker “*” represents termination codon, the left number indicates nucleotide position, the right number indicates amino acid position, the italic lowercase letters represent cloning primer sequences of RgGGPPS1 geneFig. 2　Nucleotide sequence and amino acid sequence of RgGGPPS1 gene cDNA

2个富含天冬氨酸的保守基序用黑色框标出;Si.芝麻；Sm.丹参；Sp.番茄；Nt.烟草；Pn.三七；At.拟南荠图3　地黄RgGGPPS1蛋白与其他植物中GGPPS蛋白的多序列比对分析The two Asp-rich conserved motifs are boxed in black; Si. Sesamum indicum; Sm. Salvia miltiorrhiza; Sp. Solanum pennellii; Nt. Nicotiana tabacum; Pn. Panax notoginseng; At. Arabidopsis thalianaFig. 3　Multiple sequence alignment of RgGGPPS1 and GGPPS proteins from other plant species

物种名称后括号内为蛋白登录号，节点上的数值为通过bootstrap检验次数的百分数图4　RgGGPPS1蛋白与其他物种GGPPS蛋白的系统进化树The protein accession numbers are showed after the name of species, bootstrap values of the nodes represent the percentage drawn from the bootstrap testFig. 4　Phylogenetic tree analysis of RgGGPPS1 protein and GGPPS proteins from other species

2.4RgGGPPS1原核表达载体的构建

利用含有酶切位点EcoR I和XhoI的原核表达引物，将RgGGPPS1基因插入原核表达载体pET-32a，重组质粒经EcoR I和XhoI双酶切后，有6 000 bp左右的载体片段和1 000 bp左右的插入片段(图5)。将酶切正确的单克隆进行测序，测序结果表明，重组质粒pET-32a-RgGGPPS1中插入基因序列与目的基因RgGGPPS1序列完全一致，说明RgGGPPS1基因的原核表达载体构建成功。

M. DL 2 000；1、2. EcoR I和Xho I双酶切图5　原核表达载体pET32a-RgGGPPS1的双酶切鉴定M. DL 2 000; 1, 2. Double digestion results by EcoR I and Xho IFig. 5　Identification of prokaryotic expression vector pET32a-RgGGPPS1 with double digestion

2.5RgGGPPS1重组蛋白的原核表达与纯化

将含有pET-32a和pET-32a-RgGGPPS1质粒的表达菌株，振荡培养，当大肠杆菌生长至OD600达到0.6 时，在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃、150 r/min条件下培养8 h后，对诱导前后的大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。含有pET-32a-RgGGPPS1质粒的表达菌株经IPTG诱导后，大肠杆菌总蛋白中出现1条55 kD的条带(图6)，因为RgGGPPS1重组蛋白在N-末端融合了pET-32a载体的标签序列(Trx-Tag，His-Tag和S-Tag)，总分子量为55.90 kD。含pET-32a空载体的菌株，在同样条件下培养8 h后，未在55 kD处出现条带，而在20 kD处出现条带，因为pET-32a空载体的标签序列(Trx-Tag，His-Tag和S-Tag)在IPTG诱导时也会表达融合蛋白，大小约为20 kD。结果(图6)表明，RgGGPPS1蛋白成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

根据RgGGPPS1重组蛋白的诱导条件，扩大培养体积，用超声裂解菌体，裂解液经离心取上清，利用Ni2+亲和层析纯化目的蛋白，最终得到纯化的RgGGPPS1重组蛋白(图6)。纯化的RgGGPPS1重组蛋白可用于下一步多克隆抗体制备，以及体外酶促催化实验，通过在检测体系中添加底物FPP、IPP和纯化的RgGGPPS1蛋白，用GC-MS检测产物，进一步鉴定地黄GGPPS1蛋白功能。

M. 蛋白分子量标准；1. 未诱导的含pET-32a空载体的E. coli菌株；2. IPTG诱导的含pET-32a空载体的E. coli菌株；3. 未诱导的含pET-32a-RgGGPPS1质粒的E. coli菌株；4. IPTG诱导的含pET-32a-RgGGPPS1质粒的E. coli菌株；5. 纯化的RgGGPPS1重组蛋白。箭头显示为RgGGPPS1重组蛋白图6　RgGGPPS1重组蛋白的原核表达与纯化M. Protein marker; 1. Non-induced E. coli containing pET-32a used as control; 2. E. coli containing pET-32a under IPTG inducement; 3. Non-induced E. coli containing pET-32a-RgGGPPS1; 4. E. coli containing pET-32a-RgGGPPS1 under IPTG inducement; 5. The purified recombinant RgGGPPS1 protein. The arrows show the recombinant RgGGPPS1 proteinsFig. 6　Prokaryotic expression and purification of recombinant RgGGPPS1 protein

2.6RgGGPPS1基因表达模式分析

RT-PCR结果显示，RgGGPPS1基因在地黄栽培品种‘北京3号’和野生种中，都是根中表达量最高，叶中表达量较低，茎中表达量最低，说明RgGGPPS1基因的表达具有组织特异性。在栽培品种‘北京3号’的根中RgGGPPS1的表达量高于野生种，而在叶片中RgGGPPS1的表达量则是‘北京3号’低于野生种(图7)。这样的表达模式可能和地黄以根作为入药部位有关，环烯醚萜苷类成分在膨大的块根中含量较多而在叶片中含量较少[17]。

同一组织的不同小写字母表示野生种和栽培品种在0.05水平存在显著性差异图7　地黄RgGGPPS1基因在各组织器官的表达量分析Different lowercase letters at the same tissue indicate significant difference among wild specie and cultivar at 0.05 levelFig. 7　Expression patterns of RgGGPPS1 in different organ tissues of R. glutinosa

3讨论

在地黄‘北京3号’膨大的块根中克隆了RgGGPPS1基因的cDNA序列，通过氨基酸多序列比对分析发现，RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的保守基序，据报道这2个保守基序是和底物以及产物GGPP结合的部位[18]。在不同的植物中，GGPPS蛋白定位于不同的细胞器中，如在叶绿体、内质网、线粒体等[7]，根据SignalP预测结果RgGGPPS1蛋白可能定位于叶绿体中，说明RgGGPPS1蛋白可能在叶绿体中发挥功能，在植物中GGPP由位于质体的甲基赤藓醇磷酸途径(methylerythritol phosphate pathway，MEP pathway)合成，是二萜类化合物合成的重要前体物，所以GGPPS是植物次生代谢途径的关键酶之一。地黄主要药效物质是环烯醚萜苷类化合物，目前关于环烯醚萜苷类化合物的化学和药理学研究已有良好基础，但环烯醚萜苷类化合物的生物合成途径及其关键基因方面研究较少，本研究克隆得到的RgGGPPS1基因是环烯醚萜苷类化合物生物合成途径的关键基因之一，RT-PCR结果显示在地黄中RgGGPPS1基因的表达具有组织特异性，在根中表达量最高，叶片次之，茎中最低，而且在栽培品种‘北京3号’的根中RgGGPPS1的表达量高于野生种。栽培地黄和野生地黄块根发育不同，在地黄成熟期，栽培地黄块根发育为膨大块根而野生地黄块根膨大程度较小，地黄块根能否正常发育膨大直接决定地黄的产量和药用品质[19]，栽培地黄‘北京3号’块根发育正常为膨大的块根，产量和药用品质较高，积累较多的药效物质环烯醚萜苷类成分，所以RgGGPPS1的表达量在栽培地黄‘北京3号’根中高于野生地黄。

环烯醚萜苷类化合物作地黄药效物质基础之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等多种药理活性，但是在地黄中环烯醚萜苷类化合物的含量较低，而临床需求量较大，所以如何通过生物技术提高地黄中环烯醚萜苷类化合物的含量具有重要的研究意义。随着植物次生代谢途径(如：紫杉醇和丹参酮等生物合成途径)及其关键基因研究的深入，越来越多的关键基因被克隆，功能被鉴定，通过基因工程对药用植物进行遗传改良提高药用植物体内药效物质含量，或者通过合成生物学方式直接生产有效成分，已经成为最具发展潜力的方向。本研究从地黄的块根中获得了RgGGPPS1基因的cDNA序列，通过构建原核表达载体pET-32a-RgGGPPS1，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功诱导表达出RgGGPPS1重组蛋白，而且在表达的重组蛋白的N端带有6个His-Tag标签，方便纯化重组蛋白，所以采用Ni2+亲和层析方法得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白，为下一步RgGGPPS1蛋白多克隆抗体的制备、体外酶促催化实验以及研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。

参考文献:

[1]温学森, 杨世林, 魏建和, 等. 地黄栽培历史及其品种考证[J]. 中草药, 2002, 33(10): 946-949.

WEN X S, YANG S L, WEI J H,etal. Textual research on plant ing history ofRehmanniaglutinosaand its cultivated varieties[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs, 2002, 33(10): 946-949.

[2]李红伟, 孟祥乐. 地黄化学成分及其药理作用研究进展[J]. 药物评价研究, 2015, 38(2): 218-228.

LI H W, MENG X L. Research progress on chemical constituents and pharmacological activities ofRehmanniaglutinosa[J].DrugEvaluationResearch, 2015, 38(2): 218-228.

[3]李慧芬. 地黄药理作用和临床应用概况[J]. 药学研究, 2014, 33(6): 345-347.

LI H F. Summary on pharmacological action and clinical usage ofRehmanniaeradix[J].JournalofPharmaceuticalResearch, 2014, 33(6): 345-347.

[4]SUN P, SONG S H, ZHOU L L,etal. Transcriptome analysis reveals putative genes involved in iridoid biosynthesis inRehmanniaglutinosa[J].InternationalJournalofMolecularSciences, 2012, 13(10): 13 748-13 763.

[5]郭玉海, 祁建军, 周丽莉, 等. 地黄RgPR-10基因的克隆与表达[J]. 西北农业学报, 2009, 18(1): 300-304.

GUO Y H, QI J J, ZHOU L L,etal. Clonning and expression ofRgPR-10 gene fromRehmanniaglutinosa[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica, 2009, 18(1): 300-304.

[6]刘驰, 李明杰, 王鹏飞, 等. 地黄内质网型(ER)Ca2+-ATPase基因的克隆及表达分析[J]. 植物生理学报, 2013, 49(5): 445-451.

LIU C, LI M J, WANG P F,etal. Cloning and expression analysis of endoplasmic reticulum type (ER)Ca2+-ATPaseinRehmanniaglutinosaLibosch.[J].PlantPhysiologyJournal, 2013, 49(5): 445-451.

[7]BECK G, COMAN D, HERREN E,etal. Characterization of the GGPP synthase gene family inArabidopsisthaliana[J].PlantMolecularBiology, 2013, 82(4/5): 393-416.

[8]OKADA K, SAITO T, NAKAGAWA T,etal. Five geranylgeranyl diphosphate synthases expressed in different organs are localized into three subcellular compartments inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2000, 122(4): 1 045-1 056.

[9]钟秋月, 国艳梅, 梁燕, 等. 两个不同来源的番茄GGPS基因克隆和序列分析[J]. 华北农学报, 2009, 24(3): 15-22.

ZHONG Q Y, GUO Y M, LIANG Y,etal. Cloning and sequence analysis ofGGPSgene in two sources of tomato[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica, 2009, 24(3): 15-22.

[10]张蕾, 戴住波, 崔光红, 等. 丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与分析[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(21): 2 704-2 708.

ZHANG L, DAI Z B, CUI G H,etal. Cloning and characterization of geranylgeranyl diphosphate synthase gene ofSalviamiltiorrhiza[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2009, 34(21): 2 704-2 708.

[11]李锋, 李明, 金立锋, 等. 烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析[J]. 烟草科技, 2012,(5):60-64.

LI F, LI M, JIN L F,etal. Cloning and characterization of a new gene encoding geranylgeranyl pyrophosphate synthase fromNicotianatabacum[J].TobaccoScience&Technology, 2012,(5):60-64.

[12]张洪娟, 谭碧玥, 曹福亮. 银杏GbGGPS基因的克隆及序列分析[J]. 南京林业大学学报：自然科学版, 2013, 37(4): 8-12.

ZHANG H J, TAN B Y, CAO F L. Cloning and characterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene fromGinkgobilobaLinn.[J].JournalofNanjingForestryUniversity(Natural Sciences Edition), 2013, 37(4): 8-12.

[13]吕品, 李娜, 谷辉辉, 等. 西瓜牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及表达分析[J]. 生物技术, 2014, (2): 11-15.

LÜ P, LI N, GU H H,etal. Cloning and expression analysis of geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene in watermelon (Citrulluslanatus) [J].Biotechnology, 2014,(2): 11-15.

[14]张萌, 苏平, 刘雨佳, 等. 雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(6): 1 066-1 070.

ZHANG M, SU P, LIU Y J,etal. Cloning and bioinformatics analysis of geranylgeranyl diphosphate synthase gene ofTripterygiumwilfordii[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2015, 40(6): 1 066-1 070.

[15]侯维海, 孙鹏, 陈全家,等. 地黄实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 中国农学通报, 2011, 27(17):76-82.

HOU W H, SUN P, CHEN Q J,etal. Selection of the reference genes for gene expression studies inRehmanniaglutinosaby real-time quantitative PCR[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2011, 27(17):76-82.

[16]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[17]ZHANG Y L, FENG W S, ZHENG X K,etal. Three new ursane-type triterpenes from the leaves ofRehmanniaglutinosa[J].Fitoterapia, 2013, 89(1): 15-19.

[18]JOLY A, EDWARDS P A. Effect of site-directed mutagenesis of conserved aspartate and arginine residues upon farnesyl diphosphate synthase activity[J].JournalofBiologicalChemistry, 1993, 268(36): 26 983-26 989.

[19]王鹏飞, 李鑫宇, 李明杰, 等. 地黄块根膨大发生和驱动的组织观察及激素相关基因的调控分析[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(17): 3 245-3 253.

WANG P F, LI X Y, LI M J,etal. Observation of prime position and driving zones in process of tuberous root expanding and expression analysis of phytohormone relative genes inRehmanniaglutinosa[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2014, 39(17): 3 245-3 253.

(编辑:宋亚珍)

Clone and Expression Analysis ofGGPPS1 Gene fromRehmanniaglutinosa

ZHAO Le1,2, SHI Jingjing1,2, MA Ligang1,2, HE Qingxiang1, FENG Weisheng1,2,ZHENG Xiaoke1,2, ZHU Yunhao1,2*

(1 School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 2 Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046, China)

Abstract:Rehmannia glutinosa was used as experimental material in this study. Through analyzing the transcriptome data of R. glutinosa and designing specific primers, we isolated the cDNA sequence of geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) from R. glutinosa and named as RgGGPPS1 (GenBank accession No. KU258808). Meanwhile, on the basis of bioinformatic analysis, we performed the prokaryotic expression, purification and tissue-specific expression analysis. The results indicated that: (1) RgGGPPS1 has an open reading frame (ORF) of 987 bp, which encoded a protein of 328 amino acid residues. (2) Bioinformatic analysis indicated that RgGGPPS1 protein contains the two conserved motifs (DDXXXXDD) and (DDXXD); RgGGPPS1 protein showed the highest homology, 92% identity, with GGPPS protein from Sesamum indicum. (3) By utilizing the construction of prokaryotic expression vector pET-32a-RgGGPPS1, we successfully expressed the recombinant RgGGPPS1 protein in E. coli BL21 (DE3) cells. Furthermore, the recombinant RgGGPPS1 protein was purified through Ni2+affinity chromatography. (4) Real-time PCR analysis indicated that RgGGPPS1 was expressed in high transcript level in roots, low levels in leaves and stems. The results of this study provided the fundamental information about RgGGPPS1 gene for follow-up research of its function involved in iridoid glycoside biosynthesis pathway.

Key words:Rehmannia glutinosa; RgGGPPS1 gene; bioinformatic analysis; prokaryotic expression; expression analysis

文章编号:1000-4025(2016)05-0888-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0888

收稿日期:2016-01-27;修改稿收到日期:2016-04-18

基金项目:国家“十二五”科技支撑计划(2011BAI06B02)；河南中医学院博士科研基金(BSJJ2011-07，BSJJ2011-18)；第六届河南中医学院药学院大学生创新学习项目(YXCX [2015] 3)

作者简介:赵乐(1983-)，男，博士，讲师，主要从事药用植物分子生物学研究。E-mail: zhaole1983@126.com *通信作者:朱畇昊，博士，讲师，主要从事药用植物资源研究。E-mail: guxinhan123@163.com

中图分类号:Q785;Q786

文献标志码:A