简单高效获取人脐静脉内皮细胞的方法研究

霍永宝 叶子冠 陈瑞林 陶 怡

(广州医科大学附属第二医院风湿免疫科, 广东 广州 510260)



·临床研究·

简单高效获取人脐静脉内皮细胞的方法研究

霍永宝 叶子冠 陈瑞林 陶 怡*

(广州医科大学附属第二医院风湿免疫科, 广东 广州 510260)

目的:探索简单高效的获取人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的方法。方法：采用Ⅱ型胶原酶对健康产妇正常分娩的脐带进行消化，分离出HUVECs，予含10%胎牛血清、1%内皮细胞生长液的PRM 1640培养液，在37℃、5%CO2条件下培养，分别进行细胞鉴定及活力检测。结果：分离获取的HUVECs呈典型的“鹅卵石、铺路石”样，有特异性vWF抗原表达，细胞活力好。结论：Ⅱ型胶原酶对健康产妇正常分娩的脐带进行消化分离，可获取大量纯度高、细胞活力好的HUVECs，简单高效、可行性强。

人脐静脉内皮细胞；细胞培养；原代

人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)由于其分化潜能和新生血管内皮细胞的特性，且可通过新生儿脐带消化所得，获取容易，已广泛用于体内绝大多数内皮细胞功能的研究[1-2]。本研究参考经典的HUVECs分离方法[3]，采用新生儿脐静脉内皮细胞作为细胞来源，通过胶原酶消化的方法获得原代内皮细胞，探索一种较为简单高效、重复性好的实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

脐带由广州医科大学附属第二医院产科提供。无菌条件下取健康产妇分娩后6 h内的新生儿脐带，长10～15 cm，孕产妇无基础疾病，产前检查HBsAg、人免疫缺陷病毒及梅毒均阴性。脐带剪取后立即准备实验。

1.2 主要试剂及仪器

PRM 1640培养液(Gibco公司，美国)；Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，美国)；胎牛血清(HyClone公司，美国)；内皮细胞生长因子(ECGs，ScienCell，美国)；青霉素/链霉素双抗液(Gibco公司，美国)；兔抗人vWF抗体(Abcam公司，美国)；PE结合的驴抗兔荧光二抗(R & D公司，美国)；噻唑蓝(MTT，Sigma，美国)；生物安全柜(Thermo公司，美国)；培养箱(Thermo公司，美国)；光学倒置显微镜(Olympus，日本)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)。

止血钳、镊子等为实验室常用器械，使用前均经高压灭菌处理。

1.3 方法

1.3.1 HUVECs的分离培养 无菌条件下取健康产妇正常分娩新生儿脐带10～15 cm，用20 mL 16号粗针头注射器吸取预温PBS，注入脐静脉中，止血钳固定针头并夹闭，反复冲洗至无血色液体流出。使用止血钳夹闭脐带另一端，从注射器端向脐静脉缓慢注入37℃预温的0.1%的Ⅱ型胶原酶液体约8 mL，直至脐静脉血管充盈，消化约10 min。消化时缓慢转动脐带，使胶原酶与脐静脉充分接触。打开无针头端止血钳，于50 mL离心管中收集含有内皮细胞的消化液，再次向脐静脉注入预温的PBS，冲洗2遍，收集冲洗液于上述同一离心管内，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用含胎牛血清、ECGs及双抗液的PRM 1640培养液4 mL重悬细胞。细胞计数，调整细胞密度至1.5×105～2.0×105/mL，接种于25 cm2细胞培养瓶，37℃、5%CO2条件下培养。24 h后换液继续培养，3～4 d换液一次，待细胞融合80%～90%时传代。

1.3.2 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.3.3 vWF抗原表达的免疫荧光检测 将第三代HUVECs于置有盖玻片的12孔细胞培养板上生长至约80%融合。PBS洗2遍，冰丙酮室温固10 min；吸去固定液，PBS洗3遍，1%BSA室温下封闭30 min。加入1：200兔抗人vWF抗体，并用PBS取代抗vWF抗体作阴性对照，置入湿盒，4 ℃孵育过夜。次日将湿盒取出，室温复温45 min，PBS洗3遍，加入1：200 PE标记的驴抗兔IgG荧光二抗，室温避光孵育1 h。PBS漂洗3遍，缓冲甘油封片，在荧光倒置显微镜下观察、摄像。

2 结 果

2.1 细胞形态学观察结果

分离获取的HUVEC在37 ℃、5%CO2条件下培养6 h后，大部分贴壁生长。早期细胞呈小多角型，逐渐变为短梭形，此后逐渐生长成单层，呈鹅卵石/铺路石或扁平多边形状，无堆叠，见图1。正常存活的HUVEC光镜下透亮，胞浆丰富，细胞核呈圆形/椭圆形，1～2个核仁，核周胞浆浓厚。

BA

注：A：d1；B:d7

图1 倒置显微镜下HUVEC形态(×200)

2.2 vWF抗原表达的免疫荧光检测结果

兔抗人vWF抗体与PE标记的抗兔二抗结合显示为红色荧光。PE在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，当藻红蛋白被分离纯化后，蛋白质具有较强荧光，当吸收不同波长的光后可发出亮红色荧光。在荧光倒置显微镜下可见HUVEC呈红色，细胞轮廓清晰可见(图2)。

BA

注：A：PBS取代一抗作阴性对照；B ：加入1：200兔抗人vWF抗体

图2 HUVEC的vWF免疫荧光鉴定(×200)

2.3 HUVEC生长曲线测定结果

HUVECs属上皮细胞，具有贴壁生长特性，原代细胞生长相对较慢，第三代HUVECs细胞活力良好，传代培养后3～4 d即达高峰，随后逐渐下降，生长曲线呈典型的“S”形(图3)。

0.040.030.020.010OD值0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5培养天数(d)HUVEC

图3 HUVEC生长曲线

3 讨 论

本研究采用新生儿脐静脉内皮细胞作为血管内皮细胞的来源，通过酶消化的方法获得内皮细胞原代细胞[2,4-6]。实验选取脐带的长度为10～15 cm，非国外文献所推荐的50 cm[7]，原因主要是脐带过长导致操作不方便，在生物安全柜中难以确保无菌操作。本实验主要改良的关键点包括：①选用20 mL 16号粗针头的注射器，准确找出夹在两条细小的脐动脉中间的粗大的脐静脉，注射器插入脐静脉后即予止血钳固定夹闭一端，防止注射器针头在操作过程中滑脱导致反复穿刺损伤血管内皮，同时也避免脱落后反复寻找脐静脉，止血钳固定较缝线的方法简便，实验总耗时约30 min，有效地节省了实验时间，从而保障所获取的内皮细胞的活力。②胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，而胶原成分主要为Ⅱ型胶原[8]。本实验采用37 ℃预热的Ⅱ型胶原酶消化10 min，可获得大量内皮细胞。另外，消化完毕后从注射器端注入空气使含有内皮细胞的胶原酶自然流出，较回抽消化液的方法更充分地收集到含有内皮细胞的液体。所得HUVECs在含1%内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factors，ECGs)的内皮细胞培养液下生长迅速，形态呈典型内皮细胞“鹅卵石/铺路石”状，原代细胞培养5 d即可融合80%～90%，MTT法检测生长曲线呈“S”形，经Ⅷ因子相关抗原/vWF证实为内皮细胞。

综上，本实验分离获取原代人脐静脉内皮细胞的方法操作简单，操作耗时少，结果可靠，可重复性强，可广泛用于内皮细胞的实验研究。但需要注意的是，HUVECs在多次的传代培养下容易老化、变形，一般可传5～6代，如何在保证细胞形态及状态的情况下尽可能增加传代次数，仍需进一步研究。

[1] 付 伟，李慧敏，苏建华，等. 人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定[J]. 南京医科大学学报：自然科学版,2009(01):89-91.

[2] Baudin B, Bruneel A, Bosselut N, et al. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells[J]. Nat Protoc,2007,2(3):481-485.

[3] Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria[J]. J Clin Invest,1973,52(11):2745-2756.

[4] Goon PK, Watson T, Shantsila E, et al. Standardization of circulating endothelial cell enumeration by the use of human umbilical vein endothelial cells[J]. J Thromb Haemost,2007,5(4):870-872.

[5] 牛红心，吕文成，阎 晓. 人脐静脉内皮细胞培养方法的改进及其优势[J]. 广东医学,2009, 30(11):1621-1623.

[6] 戴青原，谭小兵，赵 昭，等. 人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定[J]. 现代生物医学进展,2013, 13(28):5438-5441.

[7] Kadam SS, Tiwari S, Bhonde RR. Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim,2009,45(1-2):23-27.

[8] Responte DJ, Natoli RM, Athanasiou KA. Collagens of articular cartilage: structure, function, and importance in tissue engineering[J]. Crit Rev Biomed Eng,2007,35(5):363-411.

(本文编辑：张 辉)

A simple and efficient method for harvesting human umbilical vein endothelial cells

HuoYongBao,YeZiguan,ChenRuilin,TaoYi*

(DepartmentofRheumatology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China)

*Correspondingauthor:Email:taoyi267@126.com

Objective:To explore for a simple and efficient method for harvesting human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods:HUVECs were isolated by Type Ⅱ collagenase digestion of umbilical cord from healthy women who underwent normal delivery, and then were cultured in PRM 1640 medium liquid containing 10% fetal calf serum and 1% endothelial cell growth liquid, at 37 degrees Celsius under 5% CO2condition. The cultured cells were identified and assayed for viability. Results: After culture, the isolated HUVECs showed a typical pattern of cobblestones or paving stones, specifically expressed vWF antigens, and were with good cell viability. Conclusion: Type Ⅱ collagenase digestion of umbilical cord from healthy women who underwent normal delivery may be a simple, efficient and feasible method which massively yields highly-purified and viable HUVECs.

human umbilical vein endothelial cells (HUVECs); cell culture; primary

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.03.009

2013年广州医科大学博士启动项目(20BC51)；2015年广东省自然科学基金(2015A030313459)

R329

A

2095-9664(2016)03-0037-03

2016-02-15)

*通讯作者：Email：taoyi267@126.com