下调PPP2R5C表达对K562细胞TP53相关通路基因表达的影响

沈 琦 张新友 李扬秋

(1深圳市人民医院血液内科，广东 深圳 518020；2暨南大学血液病研究所，3暨南大学再生医学教育部重点实验室；广东 广州 510632)



·论著·

下调PPP2R5C表达对K562细胞TP53相关通路基因表达的影响

沈 琦1,2张新友1李扬秋2,3*

(1深圳市人民医院血液内科，广东 深圳 518020；2暨南大学血液病研究所，3暨南大学再生医学教育部重点实验室；广东 广州 510632)

目的:利用基因芯片技术研究RNA干扰下调PPP2R5C对K562细胞中TP53通路相关基因表达的影响。方法：Affymetrix U133 plus 2.0 基因表达谱芯片检测核转染PPP2R5C-siRNA991和SC对照组的K562细胞，应用Genespring GX 11.0软件分析差异基因相关信号通路变化情况。结果：基因芯片分析TP53信号通路紧密相关的22个基因，发现全部基因发生了差异表达，其中上调基因有8个，下调基因有14个。明显上调的基因有EP300、CCND1、BRCA2和USP7，而明显下调的基因则有MDM4、ESR1、ATM、CDK2、CDKN1A、TP53和CDKN2A。结论：下调K562细胞PPP2R5C基因时，在一定程度上选择性调节与细胞增殖密切相关的TP53信号通路相关基因的表达，从而抑制K562细胞增殖，促进了K562细胞凋亡。

PPP2R5C基因；TP53基因；基因芯片；核转染

PPP2R5C是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的一个亚单位， PP2A是一种主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，它在磷酸化信号平衡中起重要作用，影响着许多蛋白的磷酸化状态，并与一些信号传导通路的调节、细胞增殖和分化、细胞恶性转化、细胞周期调节、DNA复制/转录和胚胎发育等相关[1-3]。PPP2R5C基因定位于14q32.2，主要位于核内，在心和骨骼肌中广泛分布，PPP2R5C具有5种不同的拼接方式分别称为B56γ1、B56γ2、B56γ3、B56γ5和B56γ6，它可以编码5种不同的拼接方式蛋白。本组在研究T-ALL发病机制中则发现1例患者涉及PPP2R5C基因异位表达[4]。本组还发现，在健康人和多种白血病样本中，均可检测到各种PPP2R5C基因转录本的存在，本组再进一步检测了10例CML患者及10例CML-CR患者中PPP2R5C的表达水平，CML中PPP2R5C表达明显高于CML-CR患者及健康对照组，而CML-CR患者与健康对照组相比，则无明显差异[4]。在CML细胞株K562和Jurkat细胞株中利用核转染使PPP2R5C基因表达下调可明显抑制细胞的增殖并使细胞凋亡增加[5-6]，本组初步分析发现凋亡增加现象与Wnt、MAPK、JAK/STAT和PI3K/AKT等信号通路相关[6-7]。本研究进一步分析下调K562细胞PPP2R5C后，与细胞凋亡密切相关的TP53信号通路相关基因的变化情况，进一步明确PPP2R5C在慢性粒细胞白血病细胞增殖和凋亡中的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

本室保存K562细胞株(人慢性髓原白血病细胞)，以 5×105个细胞接种于含5 mL培养液的培养瓶中，含10%胎牛血清(美国HyClone)、100 IU/mL青-链霉素(国产)的IMDM培养基，37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱内常规培养；2～3 d传代1次，得到处于对数生长期的细胞。

1.2 核转染K562细胞

按照专用核转液提供的方法，收集K562细胞数为2.5×106，核转液量100 μL NucleofectorTMSolution和Supplement混合液(二者比例9∶2，即配即用)(德国Amaxa)(使用前需预热)悬浮细胞；分别加入1～3 μg siRNA/SC，用专用的移液管混匀后加入核转杯，启动K562细胞推荐程序T-003；程序完成后立刻用专用的移液管将转染后的细胞液，放置在37 ℃预热过的，含体积分数10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素的12孔板中，终体积为2 mL；放入培养箱8～12 h后，更换新培养液继续培养。

1.3 RNA提取

应用RNAzol试剂盒按常规方法提取K562细胞的RNA。提取后经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性

1.4 Affymetrix基因表达谱芯片

Affymetrix U133 plus 2.0 基因表达谱芯片检测核转染PPP2R5C-siRNA991和SC对照组的K562细胞，应用Genespring GX 11.0软件分析差异基因相关信号通路变化情况。

2 结果

2.1 送检PPP2R5C-siRNA991、SC两组RNA质检结果

送检PPP2R5C-siRNA3、SC两组RNA，经 Agilent 2100 Bioanalyzer质检，均合格(表1)，可用于下一步的芯片实验。基因芯片分析的杂交信号值经过均一化以及筛选，发现PPP2R5C-siRNA991转染K562细胞株的基因组中某些基因表达发生上调和下调的现象。与转染无关干扰序列RNA的SC组K562细胞相比，有963个基因上调；524个基因下调[7]，涉及信号通路改变共有473条。

2.2 分析下调PPP2R5C对K562细胞中与细胞增殖和凋亡的TP53信号通路相关的基因变化情况

本研究分析下调PPP2R5C对K562细胞中与细胞增殖和凋亡的TP53信号通路相关的22个基因的变化情况。本组发现共有8个基因上调有，14个基因下调，其中基因上调、下调倍数变化<2倍的分别有4个和7个，>2倍的分别是4个和7个。上调倍数>2倍的基因有EP300、CCND1、BRCA2和USP7，下调倍数>2倍的基因有MDM4、ESR1、ATM、CDK2、CDKN1A、TP53和CDKN2A。 EP300、CCND1、BRCA2和USP7基因分别上调了2.59倍、2.51倍、2.26倍和2.08倍，MDM4、ESR1、ATM、CDK2、CDKN1A、TP53基因则分别下调了2.07倍、2.09倍、2.29倍、2.32倍、2.35倍和2.58倍，CDKN2A基因更是下调了5.59倍，其余基因上调、下调倍数均为1倍左右(图1)。将这些基因的芯片扫描数据均一化后，再经SBC系统分析后得到热图见图2。

表1 送检PPP2R5C-siRNA991、SC两组RNA质检结果

43210-1-2-3-4-5-6-7Log2foldchangeinmRNAlevelEP300CCND1BRCA2USP7SIRT1MDM2PCNARCHY1SP1CHEK1CDK4ESR1ATMCDK2CDKN1ACDKN2ATP53AKT1BRCA1CDK4RPLI1RPL5

图1 下调PPP2R5C后K562细胞中TP53信号通路相关基因表达倍数图

图2 下调PPP2R5C后K562细胞中TP53信号通路相关基因改变热图

3 讨 论

本组前期研究已初步探讨了下调PPP2R5C后与K562细胞活化可能相关的信号通路PI3K/AKT、MAPK、Wnt、Ca2+和JAK/STAT信号通路改变情况[6,7]。然而，这些相关通路变化不能完全解释下调PPP2R5C后K562细胞的变化，尤其是凋亡增加现象的特点。

图3 TP53相关基因信号通路图

TP53(tumor protein p53)又称为p53，是一种肿瘤抑制基因，p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，它与细胞内其他信号转导通路间的联系十分复杂，活化的p53蛋白通过调控下游基因，能阻止细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定和抑制肿瘤血管生成[8]。MDM2(murine double minute 2)最初是在转化的成纤维细胞中发现的，该基因在进化上比较保守，在许多动物细胞的 染色体上都有同源序列编码一种锌指蛋白，可与p53蛋白结合，抑制p53介导的转录活性和阻止p53诱导凋亡的作用，已在多种肿瘤中发现其突变与扩增，而且mdm2突变与P53突变不共存，mdm2扩增与肿瘤转移密切相关。据以往文献报道，与TP53相关基因众多，从string905网站上得到相关信号通路图见图3。基于TP53信号通路在细胞增殖和凋亡中的作用，本研究进一步从下调PPP2R5C表达后K562细胞表达谱基因芯片结果中分析TP53相关基因表达谱特点，非常明显的变化是下调PPP2R5C表达后，K562细胞中涉及TP53相关的全部22基因表达水平均发现变化，超过2倍上、下调基因有EP300、CCND1、BRCA2、USP7、MDM4、ESR1、ATM、CDK2、CDKN1A、TP53和CDKN2A等11个基因。提示在下调PPP2R5C时，对K562细胞中P53通路基因的影响存在一定的选择性，同时也提示这些基因的上调、下调可以参与了调控PPP2R5C相关的抑制细胞增殖。下调PPP2R5C后，MDM2上调(1.5倍)，而P53明显下调(2.58倍)处于一个低表达水平，细胞增殖得到抑制，这证实了细胞正常生长情况下P53是处于一个低表达水平，它的激活会受到MDM2的活化抑制[9-10]，也反向验证了MDM2抑制剂可以有效地提高P53活化水平和细胞凋亡率[11]，同时也一定程度验证了PPP2R5C主要是通过介导P53蛋白上变化而发挥作用的[2,12]。本结果可能初步验证了下调PPP2R5C基因可能通过MDM2和P53基因来调控影响肿瘤细胞相应的信号通路，从而起到抑制细胞增殖和凋亡的作用，使细胞回到正常的生长状态[13]。下调PPP2R5C后，ATM明显下调(2.29倍)，TP53明显下调(2.58倍)，这一定程度上反向验证了PPP2R5C磷酸化又可以激活P53的肿瘤抑制功能[14]。CDKN1A和CDKN2A是细胞周期抑制因子，分别下调了2.35倍和5.59倍，同时调节细胞周期中DNA复制期和有丝分裂期的细胞周期蛋白CDK2下调了2.32倍，而细胞周期调节蛋白CCND1却上调了2.51倍，这提示下调PPP2R5C基因可能通过抑制一些细胞周期抑制基因的表达来抑制细胞的增殖和诱导细胞的凋亡。综上所述，下调PPP2R5C基因后出现的凋亡增加现象是通过TP53通路实现的，PPP2R5C基因与TP53可能具有一定的相关性，两者共同作用于CML细胞凋亡调控过程。本研究首先明确PPP2R5C表达的改变与CML细胞对TP53相关通路发生的敏感性，分析PPP2R5C基因与TP53相关性，研究结果对于明确为CML细胞中PPP2R5C基因下调调节细胞凋亡的作用具有重要的科学意义，为CML治疗靶向治疗提供新的靶点。后续研究将挑选其他细胞株对这一结论做进一步的论证工作，也为发现协同靶向抑制慢性粒细胞白血病细胞肿瘤提供更系统资料。

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(本文编辑:郑 颖)

Effect of down-regulated PPP2R5C expression on TP53 related pathway gene expression in K562 cells

ShenQi1,2,ZhangXinyou1,LiYangqiu2,3＊

(1DepartmentofHematology,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen,Guangdong518020;2InstituteofHematology,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632;3KeyLaboratoryforRegenerativeMedicine,MinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China)

*Correspondingauthor：jnyangqiuli@163.com

Objective:To investigate effect of down-regulated PPP2R5C expression on TP53 related pathway gene expression in K562 cells using gene chip technology with RNA interference. Methods:Affymetrix U133 plus 2.0 gene chip was used to determine PPP2R5C-siRNA991 nuclear transfected K562 cells and SC transfected K562 cells in the control group. Genespring GX 11.0 software was used to analyze the changes of the differential gene.related signaling pathway. Results:Twenty-two genes closely related to TP53 signaling pathway were analyzed by gene chips,and all genes were differentially expressed,including 8 up-regulated genes and 14 down-regulated genes. The significantly up-regulated genes were EP300,CCND1,BRCA2 and USP7. The significantly down-regulated genes were MDM4,ESR1,ATM,CDK2,CDKN1A,TP53 and CDKN2A. Conclusion: Down-regulation of PPP2R5C gene in K562 cells can selectively regulate TP53 related pathway gene expression,which is closely related to cell proliferation,thereby inhibiting the proliferation K562 cells and promoting the apoptosis of K562 cells.

PPP2R5C gene; TP53 gene; gene chip; nuclear transfection

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.03.001

深圳市卫生计生系统科研项目(201505005);深圳市科技计划项目(JCYJ20150403101028195);广东省高等学校科技创新重点项目(cxzd1013);广东省自然科学基金(S2013020012863);广东省高等学校高层次人才资助项目(粤财教[2013]246号-54)

R575.2

A

2095-9664(2016)03-0001-04

2016-02-15)

*通讯作者：Email：jnyangqiuli@163.com