肾上皮细胞损伤使草酸钙晶体黏附增强的分子机制

甘琼枝, 孙新园, 姚秀琼, 欧阳健明

(暨南大学生物矿化与结石病防治研究所, 广州 510632)



肾上皮细胞损伤使草酸钙晶体黏附增强的分子机制

甘琼枝, 孙新园, 姚秀琼, 欧阳健明

(暨南大学生物矿化与结石病防治研究所, 广州 510632)

摘要研究了非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)在损伤前后与一水合草酸钙(COM)和二水合草酸钙(COD)晶体的黏附作用及其引起的细胞反应, 探讨了肾结石形成机理. COM和COD晶体与损伤细胞的黏附加重了细胞的过氧化损伤程度, 导致损伤细胞的活力进一步降低, 乳酸脱氢酶(LDH)释放量和活性氧(ROS)进一步增加, 坏死细胞数量进一步增多, 细胞体积缩小, 并出现凋亡小体. COM晶体对细胞的损伤能力显著大于COD晶体. 扫描电子显微镜(SEM)观测结果表明, 损伤组Vero与COM微晶的黏附作用显著强于对照组, 且能促进COM微晶的聚集. 共聚焦显微镜观测结果表明, Vero损伤后, 其表面表达的晶体黏附分子透明质酸(HA)显著增加, HA分子是促进微晶黏附的重要原因. 细胞表面草酸钙的黏附量和晶体聚集程度与细胞的损伤程度成正相关. 本文结果从分子和细胞水平上提示, 细胞损伤是导致草酸钙肾结石形成的重要因素.

关键词细胞调控; 生物矿化; 晶体黏附; 草酸钙; 透明质酸

肾结石的形成涉及由尿液过饱和所引起的矿物成核、 晶体生长、 聚集及晶体与肾上皮细胞的黏附等过程[1]. 晶体在管腔的滞留是肾结石形成的先决条件. 计算结果表明, 体内形成的微晶通过肾脏的时间为5～10 min, 而晶体通过的管道内径为15～60 μm[2], 由于晶体在尿液中的生长速率为1～2 μm/min, 因此, 在5～10 min的时间内, 晶体不能生长到足够大来堵塞管道, 这些晶体很容易被管液冲刷掉. 即没有黏附的晶体对肾结石形成的危险性并不大.

晶体与肾上皮细胞的黏附是晶体滞留的一种重要方式[3]. 晶体只有在与肾上皮细胞黏附之后, 才有足够的时间在细胞表面生长或与其它晶体相互聚集, 形成大尺寸的晶体, 并最终导致肾结石的形成. 细胞损伤是发生黏附的首要条件[4].

正常人的肾小管上皮细胞具有完整的结构, 能很好地抵制晶体的黏附[5]. 但是, 当细胞受到损伤后, 其表面会表达大量带负电荷的分子, 如骨桥蛋白(OPN)、 透明质酸(HA)和CD44等[6,7], 这些分子可以吸附Ca2+离子和黏附表面带正电荷的草酸钙晶体; 同时, 被黏附的晶体还可以诱导细胞产生自由基, 通过脂质过氧化反应进一步损伤肾上皮细胞[8], 从而增加肾结石形成的危险性.

尽管尺寸为几十微米的晶体与细胞的黏附早有报道[9,10], 但关于1 μm及以下尺寸的草酸钙晶体与肾上皮细胞黏附作用的报道很少. 我们的前期研究[11,12]表明尿液中同时存在纳米、 亚微米和微米尺寸的晶体.

微晶尺寸越小, 其比表面积就越大, 表面能也越大, 其与细胞特别是损伤细胞发生黏附作用的可能性就越大. 因此, 研究亚微米和纳米尺寸的草酸钙晶体, 特别是同时比较研究尿液中常见的、 但正常人与结石患者尿液中存在差异的一水合草酸钙(COM)和二水合草酸钙(COD)晶体与肾上皮细胞的作用差异, 可以从分子和细胞水平上了解尿石症形成的机制, 为预防尿石症的发生提供启示.

1实验部分

1.1试剂与仪器

非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)购于中国科学院上海细胞库; 细胞增生分析试剂盒(CCK-8)购于日本同仁化学研究所; 细胞培养板购于日本Iwaki公司; 改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)和胎牛血清(Hyclone)购于海克隆生物化学制品(北京)有限公司; 青霉素和链霉素购于北京普博生物技术有限公司; 30%(质量分数)过氧化氢(H2O2)、 氯化钙和草酸钾等常规试剂均为分析纯试剂. 生物素化的透明质酸结合蛋白(bHABP)购于德国MERCK公司; 碘化丙啶(PI)、 苏木素-伊红(HE)染料、 活性氧检测试剂盒[2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)]、 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液、 抗荧光猝灭封片剂和牛血清白蛋白(BSA)均购于上海碧云天生物技术有限公司; 异硫氰酸荧光素-亲和素(FITC-Avidin)购于武汉博士德生物工程有限公司.

X-L型环境扫描电子显微镜(SEM, 荷兰Philips公司); LSM510 META DUO型激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司); Safire2型酶标仪(瑞士Tecan公司); Gallios流式细胞仪(美国Beckman Coalter公司); Optima 2000 DV型电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES, 美国Perkin Elmer公司).

1.2实验过程

1.2.1COM和COD晶体的制备及晶体悬浮液的配制尺寸约1 μm的COM和COD晶体参照文献[13]方法合成. 用无血清的培养基配制浓度为100 μg/mL的COM和COD悬浮液.

1.2.2非洲绿猴肾细胞株(Vero)的培养用含10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青霉素、 链霉素的DMEM培养液在37 ℃、 含5%CO2和饱和湿度下的培养箱中培养Vero细胞, 采用胰蛋白酶消化法对细胞进行传代. 当细胞融合达80%～90%后用磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH=7.2～7.4)洗涤2次, 加入0.25%胰酶-乙二胺四乙酸二钠(EDTA)消化液1 mL, 于37 ℃培养箱中放置约3～5 min, 在倒置显微镜下观察消化程度, 消化适度后, 加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化, 充分吹打分散细胞, 得到单细胞悬液.

1.2.3细胞损伤和检测将Vero细胞按浓度为1.5×105Cell/mL、 100 μL/孔接种于96孔培养板中, 加入10% 胎牛血清的DMEM培养液孵育24 h. 实验模型分为3组: (A) 正常对照组: 吸除培养液, 用PBS洗涤细胞2次, 加入无血清培养液, 不加任何试剂; (B) 损伤对照组: 吸除培养液, 用PBS洗涤细胞2次, 分别加入0.3, 0.5, 1.0和2.0 mmol/L H2O2的无血清培养液损伤1 h; (C) 晶体处理组: 细胞分别经各浓度的H2O2损伤1 h后, 吸除培养液, 用PBS洗涤2次后加入含100 μg/mL COM和COD的无血清培养液, 作用6 h. 达到孵育时间后, 按CCK-8试剂盒测试方法用酶标仪测定光密度(OD)值, 并计算细胞活力.

1.2.4乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测将Vero细胞按浓度为1.5×105Cell/mL、 100 μL/孔接种于96孔培养板中并孵育24 h. 在细胞同步化后, 将各培养孔按照上述方法分成3组. 达到作用时间后, 严格按照LDH试剂盒说明书进行操作, 在490 nm处测定吸光度.

1.2.5苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态将Vero细胞按浓度为1.5×105Cell/mL、 1 mL/孔接种于底部铺有玻片的12孔培养板中, 加入10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养液孵育24 h. 实验分组同上. 达到作用时间后吸除上清液, 用PBS洗涤2～3次后用多聚甲醛于室温固定15 min, 再用PBS洗涤3次, 用苏木素溶液染色15 min, 用纯水将多余的苏木素清洗掉后, 用伊红染色液复染5 min; 多余的伊红用纯水清洗掉后, 在显微镜下观察细胞形貌. 细胞核呈蓝紫色, 而细胞浆呈粉红色或红色.

1.2.6碘化丙啶(PI)染色观察将Vero细胞按浓度为1.5×105Cell/mL、 1 mL/孔接种于底部铺有盖玻片的12孔培养板中, 加入10%胎牛血清的DMEM培养液孵育24 h, 实验分组同上. 达到作用时间后吸除上清液, 将种好细胞的爬片用PBS洗涤2～3次, 然后加入5 μL碘化丙啶染色液, 混合均匀, 于4 ℃孵育20～30 min后在荧光显微镜下观察. PI定量分析: 将细胞按浓度1.5×105Cell/mL、 100 μL/孔接种于96孔培养板中, 进行上述操作后采用酶标仪直接测定PI的荧光强度.

1.2.7活性氧(ROS)检测实验分组同上. 达到培育时间后吸除上层清液, 将种好细胞的爬片用PBS清洗2～3次, 加入500 μL按照1∶1000体积比用无血清培养液稀释的DCFH-DA, 于37 ℃细胞培养箱内孵育30 min, 再用PBS清洗3次, 以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA, 12孔板中的细胞用荧光显微镜进行观察, 96孔板中的细胞用酶标仪检测其荧光强度.

1.2.8透明质酸表达检测将Vero细胞按浓度1.5×105cell/mL、 1 mL/孔接种于12孔培养板中, 待细胞同步化后, 将细胞分组, 分别加入COM或COD晶体. 孵育6 h后, 吸除上层清液, 用PBS洗涤细胞2次, 用固定液[5%(体积分数)冰醋酸+10%(体积分数)福尔马林+70%(体积分数)乙醇]固定细胞20 min, 然后用PBS洗涤细胞 3 次, 每次5 min, 再加入100 μL 5 μg/mL的bHABP溶液(配制在3%牛血清白蛋白溶液中, 现用现配), 于4 ℃下孵育过夜; 之后用PBS洗涤细胞 3 次, 每次5 min; 再加入100 μL 异硫氰酸荧光素-亲和素孵育细胞1 h后, 用PBS洗涤3次, 每次5 min; 加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液复染4 min, 用PBS洗涤3次, 每次5 min; 最后用抗猝灭剂封片, 于共聚焦显微镜下观察, 细胞表面表达透明质酸处为绿色, 细胞核经DAPI染色为蓝色.

1.2.9COM和COD微晶与细胞黏附的SEM观测细胞经COM和COD悬浮液孵育6 h后, 吸除上层清液, 用PBS洗涤3次, 用2.5%戊二醛于4 ℃固定24 h后, 再用1%OsO4固定1 h, 用PBS洗涤3次, 梯度乙醇(30%, 50%, 70%, 90%和100%)脱水, 乙酸异戊酯置换多余乙醇后用CO2临界干燥, 喷金包被后在X-L型环境扫描电子显微镜下观察晶体黏附性.

1.2.10晶体黏附量的测定细胞种板密度及实验分组与HA检测相同. 在4 ℃下细胞与晶体作用6 h后, 吸除上层清液, 取出玻片; 用PBS洗涤玻片3次, 洗去未黏附的晶体; 然后将洗好的玻片放置在25 mL烧杯中, 加入10 mL 浓HNO3和1.0 mL HClO4后, 在电炉上消化至溶液澄清, 再加热蒸至近干时停止加热, 利用余热将溶液蒸干, 冷却, 加入3 mL超纯水, 混匀待测, 同时准备空白组(即10 mL 浓HNO3与1.0 mL HClO4的混合溶液), 利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)准确测定钙离子的浓度, 然后换算成草酸钙晶体的黏附量.

2结果与讨论

2.1COM与COD微晶的表征

2.2细胞活力和乳酸脱氢酶释放量变化

采用CCK-8法测定了经不同浓度H2O2损伤后的Vero细胞活力及这些损伤细胞与COM和COD作用6 h后细胞活力的变化. 由图2(A)可见, 在c(H2O2)=0～2.0 mmol/L浓度范围内, H2O2对Vero 的损伤呈现浓度依赖性; COM对损伤细胞的再损伤作用明显强于COD. 例如当c(H2O2)=1.5 mmol/L时, COD组的细胞活力与相应损伤对照组的差值为8.1%, 而COM的差值为37.0%. 当c(H2O2)=2.0 mmol/L时, 由于细胞的损伤程度太大, 导致细胞活力均很小. 因此, 后面的实验只做到c(H2O2)=1.0 mmol/L. 随着c(H2O2)增大, 细胞的LDH释放量增加, 呈浓度依赖关系[图2(B)], 且COM组的LDH释放量显著升高, 亦表明COM对细胞的损伤作用比COD大.

2.3不同损伤程度细胞的形貌观察

为了观察COM和COD晶体对受损Vero细胞的进一步损伤, 采用苏木素-伊红(HE)染料对细胞进行染色来观察细胞的整体形态. 随着H2O2浓度增大, 细胞受损程度明显, 主要表现为细胞数量的减少(图3). 而经COM和COD晶体处理后的细胞数目又明显少于只经过H2O2处理后的细胞. 晶体处理组细胞体积缩小, 嗜酸性染色增强, 部分细胞核固缩成蓝黑色, 并出现凋亡小体[14]. COM对受损Vero细胞的进一步损伤更加严重, 特别是在0.5和1.0 mmol/L H2O2处理下, 细胞的形态明显紊乱.

2.4碘化丙啶染色检测细胞死亡率

PI是一种与细胞核内DNA特异性结合的荧光染色剂, 在相同视野下, 被PI染红的细胞核数目越多, 说明死亡细胞的数目越多. 从图4和图5可以看出, 对于对照组, 被PI染红的细胞核的数量和荧光强度随着H2O2浓度的增加而增加, 说明细胞的死亡数对H2O2的刺激具有浓度依赖性.

对于COM组, 被PI染红的细胞核数量和荧光强度均比相应对照组显著增加(图5); 相比之下, COD组的荧光强度只比相应对照组稍微增加. 即在相同的细胞损伤程度下, COM晶体对Vero细胞的损伤作用大于COD晶体. 图4中出现的红点大小不一致的情况可能是由于凋亡细胞的细胞核缩小, 核内染色质浓缩, 并出现凋亡小体, 因此观察到的红点变小; 而坏死细胞的体积增大, 细胞核肿胀, 观察到的红点较大. H2O2对Vero细胞的损伤属于自由基损伤的一种. H2O2与细胞膜的类脂质结合形成过氧化脂质, 破坏胞内组分及细胞膜系统, 使多种胞内酶[如乳酸脱氢酶LDH, 见图2(B)]漏出到细胞间隙, H2O2还能与细胞内大分子如核酸、 蛋白质、 脂肪等共结合, 破坏细胞内成分, 造成细胞死亡[8]. 文献[15]用浓度分别为0.31, 0.63和1.25 mmol/L的H2O2损伤美国负鼠近端小管上皮细胞(OK) 30～60 min后, 细胞活力依次下降. Gonzalez等[16]使用浓度为0.5和3 mmol/L的H2O2损伤MDCK-II细胞60 min后, LDH的释放量逐渐升高, 跨膜电阻(TER)逐渐降低.

2.5活性氧(ROS)检测

ROS能够迅速与细胞内大分子反应, 导致正常细胞功能损害, 最终导致细胞死亡, 这种氧化性的细胞损伤能够促进草酸钙晶体在肾脏部位的沉积[17]. 选取DCFH-DA荧光探针观测COM和COD晶体诱导Vero细胞内产生的活性氧变化(图6). 相比于对照组细胞, H2O2, COM和COD晶体都能够诱导细胞产生ROS. H2O2的浓度越大, 细胞内ROS的绿色荧光强度越强. 在加入晶体后, 细胞内ROS的荧光强度进一步增强, 这表明COM和COD对受损细胞产生了进一步的氧化性损伤, 且COM比COD引起了更多的ROS产生.

2.6细胞表面表达的透明质酸检测

图7为不同损伤程度的Vero细胞与COM和COD黏附后的HA表达结果. 当损伤细胞的H2O2浓度由0增加到0.3, 0.5和1.0 mmol/L时, 黏附COD, COM后细胞的绿色荧光度依次增加, 表明细胞表面HA的表达增强. 对于相同损伤程度的细胞, COM黏附组的绿色荧光总是比COD组强, 说明COM导致细胞表达的HA更多.

2.7细胞与晶体黏附的SEM观察和黏附量测定

图8和图9为不同损伤程度的Vero细胞分别与COM和COD作用6 h后的SEM照片. 对于COM晶体, 随着细胞的损伤程度增加, 不但黏附的晶体数量增加, 而且黏附晶体的聚集程度显著增加[图8(B)和(C)].

对于COD晶体, 虽然晶体的黏附量也随着细胞的损伤程度增加而有所增加, 但增加的幅度明显减小, 晶体的聚集程度也远比COM的小[图9(B), (C)].

采用ICP检测了不同损伤程度的Vero细胞对COM和COD黏附量的差异, 结果如图10所示. 随着细胞的损伤程度增加, COM和COD晶体的黏附量均逐渐增大, 且COM组的黏附量显著大于COD组.

2.8细胞损伤后对草酸钙晶体黏附增强的分子机制

受损的细胞表面会表达黏附分子. 从图8和图9可以看出, 肾上皮细胞损伤程度增加后, 其表面黏附的草酸钙晶体量增加. 这是因为, 细胞损伤后不但导致了带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露在细胞表面[17,18], 而且还表达了多种晶体黏附分子如HA[19]、 OPN、 CD44、 膜联蛋白II、 含唾液酸的糖蛋白和核仁素相关蛋白(NRP)[20]等. 这些分子均含有阴离子基团, 如NRP有一个高度酸化的区域, 62%的残基含有天冬氨酸和谷氨酸[21]. 这些带负电荷的分子不但可以通过静电作用力与草酸钙晶体结合, 而且可以通过氢键与草酸钙中的草酸根(Ox2-)作用, 导致损伤细胞对晶体的滞留能力大大增强, 从而增加了结石形成的危险.

AFM观察结果也表明COM与损伤细胞基底膜的黏附力更大[22], 由对照组的(0.25±0.08) nN升高至(0.40±0.13) nN. 因低糖培养而受损的MDCK-I细胞对COM的黏附量比对照组提高了2.7倍[23]. 随着细胞损伤程度的增加, 其表达的黏附分子会越来越多(图7), 从而对晶体的黏附也会增强(图8和图9).

损伤使细胞膜破裂, 从细胞内释放出的有机物质以及细胞膜碎片会促进COM晶体的黏附、 聚集和生长. Chutipongtanate等[24]研究发现血红细胞RBC细胞膜碎片能够非常明显地促进COM晶体的生长和聚集, 并比对照组在晶体尺寸和聚集体的数量方面分别增加约75%和2.5倍, 且约有50%的COM晶体被RBC细胞膜碎片黏附; 相比之下, RBC细胞膜碎片对COD晶体的生长和聚集没有影响.

2.9草酸钙晶体与受损Vero细胞黏附能力的分析

损伤细胞对COM的黏附力比COD强, 这提示当体内肾上皮细胞受到损伤时, 会对尿液中COM晶体黏附增多, 并导致聚集和滞留在损伤部位, 因此, 尿液中生成更多的COM晶体比生成COD更会增大结石形成的危险性.

3结论

随着肾上皮细胞受损程度的增加, 其对COM和COD晶体的黏附量均增加, COM的聚集程度也增加. COM对细胞的损伤能力远大于COD. 细胞表面COM的黏附量和晶体聚集程度与细胞的损伤程度成正相关. 肾上皮细胞损伤程度越大, 诱导结石形成的风险越大.

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(Ed.: F, K, M)

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21371077).

Molecular Mechanism of Adhesion of Monohydrate and Dihydrate alcium Oxalate Crystals on Injured Kidney Epithelial Cells†

GAN Qiongzhi, SUN Xinyuan, YAO Xiuqiong, OUYANG Jianming*

(InstituteofBiomineralizationandLithiasisResearch,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

KeywordsCell-mediation; Biomineralization; Crystal adhesion; Calcium oxalate; Hyaluronic acid

AbstractEffects of cell injury on calcium oxalate monohydrate(COM) and calcium oxalate dihydrate(COD) microcrystalline adhesion and cellular response of calcium oxalate microcrystalline on African green monkey renal epithelial(Vero) cells after adhesion were evaluated. COM amd COD crystal adhesion to injured Vero cells increased oxidative damage degree, the LDH release amount, reactive oxygen species(ROS) and dead cells and decreased cell viability. The cells shrinked and apoptotic bodies appeared. COM crystals caused more serious damage to injured Vero cells than COD crystals. The results of scanning electron microscopy(SEM) showed that the adhesive capacity of injured Vero cells to COM was significantly stronger than the control group, which enhanced crystals adhesion and aggregation. Laser scanning confocal microscope showed that Vero cell injury increased the expression of crystal binding hyaluronic acid(HA) molecules which were the most important reasons for promoting microcrystalline adhesion. The microcrystalline adhesion and aggregation on cellular surface were positively correlated to cell injury degree. These findings indicated that cell injury was the leading risk factor of kidney stone formation, which may provide insights into the mechanisms of kidney stone formation from molecular and cellular levels.

收稿日期:2016-01-15. 网络出版日期: 2016-05-26.

基金项目:国家自然科学基金(批准号: 21371077)资助.

中图分类号O614.23

文献标志码A

联系人简介: 欧阳健明, 男, 博士, 教授, 主要从事生物矿化和纳米材料研究. E-mail: toyjm@jnu.edu.cn