复方广金钱草合剂改善肾草酸钙结石大鼠肾功能的效果及其机制

林深常 李运景 赵伟国

摘要 目的：探討复方广金钱草合剂改善肾草酸钙结石大鼠肾功能的效果及其机制。方法：将SPF级雄性SD大鼠40只随机分为观察组和对照组，每组20只。观察组采用L-羟脯氨酸注射法诱导创立肾草酸钙结石大鼠模型，并以复方广金钱草合剂灌胃干预28 d。分别于对照组入组后和观察组建模前、建模后1 d、建模后28 d收集尿液标本，进行尿量、尿蛋白、尿肌酐、尿钙等肾功能相关指标的检测。并在收集尿液标本的同时取2组尾静脉血2 mL，进行血肌酐、血尿素氮等肾功能指标的检测。观察组干预28 d均双肾标本，其中左肾制成10%匀浆进行丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平检测，右肾组织切片并通过免疫组织化学检测骨桥蛋白（OPN）和转化生长因子-β（TGF-β）等炎性相关蛋白表达情况。结果：与对照组比较，观察组建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与同组建模前比较，观察组建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与同组建模后1 d比较，观察组建模后28 d尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，观察组肾组织MDA水平以及OPN、TGF-β阳性表达率升高，SOD、GSH-Px水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：复方广金钱草合剂可改善肾草酸钙结石大鼠肾功能，而改善氧化应激和炎性反应可能为其作用机制。

关键词 复方广金钱草合剂;肾结石;草酸钙;大鼠;肾功能;氧化应激;炎性反应

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of Compound Herba Desmodii Mixture on renal function in rats with calcium oxalate calculi.Methods：A total of 40 male SPF SD rats were randomly divided into a study group and a control group， with 20 rats in each group.The model of calcium oxalate nephrolithiasis was induced by L-hydroxyproline injecting in the study group.The rats were treated with Compound Herba Desmodii Mixture for 28 days.Urine samples were collected from the control group and study group before modeling， 1 day after modeling and 28 days after modeling.The urine volume， urinary protein， urinary creatinine and urinary calcium were detected.At the same time of urine samples taking， 2 mL of caudal vein blood were collected from the 2 groups.Serum creatinine， blood urea nitrogen and other renal function indexes were detected.The left kidney was made into 10% homogenate to detect the contents of MDA， SOD and GSH-Px.The right kidney was sectioned and the expressions of osteopontin（0PN）and transforming growth factor-beta（TGF-beta）were detected by immunohistochemistry.Results：Compared with those of the control group， the urine volume of the study group one day after the establishment of the model decreased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group one day after the establishment of the mode were increased（P<0.05）.Compared with those of the same group before modeling， the urine volume of the study group 1 day after modeling decreased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group 1 day after modeling increased（P<0.05）.Compared with those of the same group one day after model was established， the urine volume of the study group 28 days after modeling increased， while the urine protein， urine creatinine， urine calcium， serum creatinine and serum urea nitrogen levels of the study group 28 days after modeling decreased（P<0.05）.Compared with those of the control group， the content of MDA and the positive expression rate of 0PN and TGF-beta in renal tissue of the study group increased， while the content of SOD and GSH-Px of the study group decreased（P<0.05）.Conclusion：Compound Herba Desmodii Mixture can improve renal function in rats with calcium oxalate calculi， and improvement of oxidative stress and inflammation may be its mechanism.

Keywords Compound Herba Desmodii Mixture; Kidney stone; Calcium oxalate; Rat; Renal function; Oxidative stress; Inflammation

中图分类号：R289.5;R695文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.03.019

肾结石为临床常见多发病，其中肾草酸钙结石为其常见类型，不但可给患者带来较大痛楚，且可影响其肾功能[1-2]。对肾草酸钙结石进行治疗十分重要。寻找有效抑制结石形成的药物或抑制结石沉积于肾的药物并揭示其机制为目前研究热点之一。近年来，中药在肾结石中的应用较多，其中广金钱草在肾结石中的应用已得到研究认可[3-5]。本研究亦关注了复方广金钱草合剂改善肾草酸钙结石大鼠肾功能的效果，并通过其肾脏氧化应激和炎性反应变化分析药物可能作用机制，旨在为肾草酸钙结石治疗中复方广金钱草合剂的应用提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠40只，均由广东省医学实验动物中心提供，体质量180～230 g，均采用正常颗粒饲料进行喂养，自由摄食饮水。所有大鼠购置后均适应性饲养1周后方入组进行实验研究。

1.1.2 药物 复方廣金钱草合剂。

1.1.3 试剂与仪器 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、骨桥蛋白（OPN）和转化生长因子-β（TGF-β）等相关试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司。采用lympus Aul000自动分析仪，相关试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司，具体检测操作严格按照仪器及相关试剂盒说明书指导进行。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将SPF级雄性SD大鼠40只随机分为观察组和对照组，每组20只。观察组采用2.5 kg/kg体质量的0.25%L-羟脯氨酸连续腹腔注射7 d诱导创立肾草酸钙结石大鼠模型。

1.2.2 给药方法 观察组采用中山市人民医院制剂室生产的复方广金钱草合剂（金钱草60 g、海金沙15 g、郁金10 g、鸡内金10 g、车前子10 g、瞿麦15 g、党参15 g、黄芪15 g、菟丝子10 g、山药15 g、木通10 g、滑石25 g、泽泻10 g、甘草5 g，科室自制，批号：20181005）以凉开水冲泡为10 mL混悬液灌胃连续干预28 d。

1.2.3 检测指标与方法 对照组入组后和观察组建模前、建模后1 d、建模后28 d收集尿液标本，进行尿量、尿蛋白、尿肌酐、尿钙等肾功能相关指标的检测。并在收集尿液标本的同时取2组尾静脉血2 mL，进行血肌酐、血尿素氮等肾功能指标的检测。将获取的尿液和血液标本以3 500 r/min转速，3 cm半径离心5 min，待分层后分装于1 mL冷冻管中常规进行冷藏待测处理。观察组干预28 d后取2组双肾标本，其中左肾制成10%匀浆进行丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平检测。2组大鼠右肾组织切片并通过免疫组织化学检测骨桥蛋白（OPN）和转化生长因子-β（TGF-β）等炎性相关蛋白表达情况，将获得的标本常规进行石蜡包埋，制成4 μm连续切片，常规进行免疫组织化学染色观察，相关试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司。每个样本均随机选取5个高倍视野（×400）进行观察，以出现黄色或棕黄色染色为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计数资料以百分率表示，比较采用χ2检验，计量资料均符合正态分布并采用均数±标准差（±s）表示，两独立样本均数进行组间t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者肾功能比较

与对照组比较，观察组建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与本组建模前比较，观察组建模后1 d尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与同组建模后1 d比较，观察组建模后28 d尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 2组患者氧化应激指标比较

与对照组比较，观察组肾组织MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平则降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 2组患者OPN、TGF-β比较

与对照组比较，观察组肾组织OPN、TGF-β阳性表达率升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 2组患者肾组织OPN和TGF-β免疫组织化学染色比较 见图1、2。

3 讨论

尿石症是一种常见的威胁人类健康疾病，其中约70%为草酸钙结石[6-7]。肾草酸钙结石患者的草酸钙结晶在肾小管上皮细胞中黏附形成结石颗粒，可给患者带来较大困扰，且其造成的肾小管上皮损伤可进一步导致肾功能损伤，严重威胁患者健康[8-10]。因此，对肾草酸钙结石进行及时有效的防治十分重要。大鼠肾草酸钙结石模型在鼠肾草酸钙结石发病机制及其干预研究中的应用较多，可通过实验方法确定可能有效药物及其机制[11-13]。本研究亦采用采用L-羟脯氨酸注射法诱导创立肾草酸钙结石大鼠模型并进行相关研究，研究中发现肾草酸钙结石大鼠尿量降低，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平升高，提示肾草酸钙结石可对肾功能造成较为明显的影响。

近年来结石治疗取得了较大进展。以往结石的治疗以西医治疗为主，最为常见的临床治疗方法为手术治疗，患者经体外冲击波碎石常可出现多种后遗症，而一般的保守西药治疗效果欠佳，常可存在结石残留，且临床复发极为常见[14-15]。改善结石治疗方法是目前急需解决的难题。中医药在临床的应用近年来不断增加，已有研究表明广金钱草在结石干预中效果良好，广金钱草中黄酮、生物碱、酚类、鞣质、多糖、皂苷、有机酸等化学成分，尤其是其中的黄酮，酮类化合物在肾结石治疗中的效果已得到研究认可[16-17]。本研究亦探讨复方广金钱草合剂改善肾草酸钙结石大鼠肾功能的效果及其机制，结果发现，复方广金钱草合剂干预28 d后肾草酸钙结石大鼠的尿量升高，尿蛋白、尿肌酐、尿钙、血肌酐、血尿素氮水平降低，证实了复方广金钱草合剂干预肾草酸钙结石的良好效果，这与刘天竹等[18]研究中广金钱草干预结石效果良好的结论一致。而本研究中肾草酸钙结石大鼠肾组织MDA水平以及OPN、TGF-β阳性表达率均升高，SOD、GSH-Px水平则降低，提示氧化应激和炎性反应可能在肾草酸钙结石形成中具有重要作用，而其中肾脏指标改善效果良好大鼠的氧化应激和炎性反应均较轻，提示改善氧化应激和炎性反应可能为复方广金钱草合剂改善肾草酸钙结石大鼠肾功能的机制。

综上所述，复方广金钱草合剂可改善肾草酸钙结石大鼠肾功能，而氧化应激和炎性反应干预可能为其作用主要途径。

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（2019-03-07收稿 责任编辑：杨觉雄）