川芎嗪对宫颈癌Hela细胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表达的影响

张　涛　宋庆娇　荣光影　柳朝阳　汪　悦

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江　佳木斯　154007)

川芎嗪对宫颈癌Hela细胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表达的影响

张涛宋庆娇荣光影1柳朝阳2汪悦3

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究川芎嗪(TMP)对Hela细胞磷酸化Bad(p-Bad)蛋白和Survivin蛋白表达的影响。方法四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测TMP对Hela细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测细胞凋亡率；Western印迹法检测p-Bad和Survivin蛋白的表达。结果与对照组相比TMP可抑制Hela细胞的增殖(P<0.01)；增加Hela细胞的凋亡率(P<0.05，P<0.01)；降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表达(P<0.05，P<0.01)。结论TMP可抑制Hela细胞增殖，诱导Hela细胞凋亡，降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表达，这可能是TMP诱导Hela细胞凋亡的机制之一。

〔关键词〕川芎嗪；宫颈癌；细胞凋亡；磷酸化Bad蛋白；Survivin蛋白

川芎嗪(TMP)是中药川芎根茎中的生物碱单体，临床上主要用于治疗多种心血管疾病〔1，2〕。目前报道，TMP的抗肿瘤〔3～7〕作用主要见于对肺癌、白血病、黑色素细胞瘤和胃癌的抑制作用，TMP对宫颈癌的抑制及其作用机制国内外暂无报道。本实验旨在探讨TMP诱导Hela细胞凋亡的作用机制。

1材料与方法

1.1材料细胞株：Hela细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所细胞库。 药物和试剂：TMP纯品购于Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于北京拜尔迪生物技术公司。AV-FITC凋亡检测试剂盒、兔抗人Survivin抗体和抗人β-actin抗体、Bad蛋白磷酸化(p-Bad)抗体购于艾美捷科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养Hela细胞复苏后，RPMI 1640培养基培养，37℃、5% CO2培养，选对数生长期时的细胞进行实验。

1.2.2MTT法检测细胞增殖胰酶消化调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔板，100 μl/孔，培养24 h，分别给予不同浓度的TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)处理，每个浓度设4个复孔。分别处理(24、48、72)后进行检测，加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl培养4 h，每孔加入200 μl DMSO，于490 nm处检测吸光度(OD)值。同时设空白对照组，有细胞，无药物。细胞增殖抑制率(IR)=(1-实验组OD均值/对照组OD均值)×100%。

1.2.3膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin-V FITC)染色流式细胞仪观察Hela细胞凋亡Hela细胞接种于培养瓶中常规培养，24 h后加入TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)，培养24 h。根据试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测，利用FCSExpress 3.0软件分析细胞凋亡。

1.2.4Western印迹法检测Survivin及p-Bad蛋白表达收集对照组及TMP(1.0，1.5，2.0 mg/ml)处理的Hela细胞，提取总蛋白，用Bradford法测定各组蛋白质含量。蛋白上样后，进行凝胶电泳，移膜，4℃用5%脱脂牛奶封闭1 h后加入兔抗人抗体(1∶100)，过夜，加二抗(1∶10 000)，杂交1 h。采用ECL法分析检测结果，以β-actin为对照蛋白，各组蛋白条带进行灰度分析，计算Survivin和p-Bad蛋白表达水平。

1.3统计学处理采用SPSS11.3软件进行单因素方差分析及LSD检验。

2结果

2.1TMP抑制Hela细胞增殖MTT法结果显示，与对照组相比，不同浓度的TMP作用于Hela细胞可明显抑制细胞的增殖(P<0.01)；各时间点均以2.0 mg/ml浓度的抑制率最高，具有剂量依赖性和时间依赖性。见表1。

2.2TMP对Hela细胞凋亡率的影响不同浓度的TMP作用于Hela细胞24 h后，与对照组相比，随着药物浓度的增加，早期凋亡率、晚期凋亡率或坏死细胞逐渐上升(P<0.05，P<0.01)(0.25 mg/ml组除外)，具有浓度依赖性，见表2。

2.3TMP对Hela细胞p-Bad蛋白及Survivin蛋白表达的影响与对照组相比，不同浓度的TMP作用于Hela细胞48 h后，可见随药物浓度的增高，p-Bad蛋白及Survivin蛋白的表达逐渐降低，呈一定的浓度依赖性，见表3。

表1　不同浓度的TMP对Hela细胞增殖的影响

与对照组比较:1)P<0.01

表2　TMP对Hela细胞凋亡的影响

与对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

表3　TMP对Hela细胞磷酸化Bad蛋白和Survivin

与对照组比较:1)P<0.01；与TMP 0.25 mg/ml组比较:2)P<0.01；与TMP 1.0 mg/ml组比较:3)P<0.05

3讨论

宫颈癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤之一，死亡率占女性癌症的第二位〔8〕。研究证明，500 mg/L TMP对人胃低分化腺癌有一定杀伤作用，抑制率约为24.4%～28.5%〔3〕；TMP能轻度抑制敏感性白血病K562细胞的DNA合成〔4〕；≥250 mg/L的TMP对体外培养的B16-FIO黑色素瘤细胞DNA、RNA和蛋白质合成具有抑制作用，并存在剂量依赖关系〔5〕；TMP对肺癌A549细胞有明显的增殖抑制作用，机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的〔6〕；TMP通过诱导Bel-7402肝癌细胞株分化抑制细胞增殖〔7〕。本实验结果显示，TMP能够抑制Hela细胞增殖及诱导细胞凋亡。

Bad是 Bcl-2家族中的促凋亡基因。Bad在多种细胞中表达，研究表明Bad可通过与Caspase家族成员的相互作用和作用于细胞信号转导通路参与细胞凋亡全过程。接受细胞凋亡信号刺激后，钙调磷酸酶可诱导 Bad去磷酸化，去磷酸化的游离 Bad 通过易位等细胞活动促进凋亡的发生〔9〕。

Bad蛋白对凋亡的调控与其磷酸化-去磷酸化修饰有关，生理状态下，p-Bad一方面与 14-3-3 蛋白结合成复合物稳定存在于胞质中发挥抗凋亡效应；另一方面，p-Bad与bcl-2解聚，而游离的bcl-2发挥抗凋亡作用〔10〕。

Survivin是抗凋亡蛋白家族(IAP)中最小的一个抗凋亡基因，在正常组织(子宫内膜等少数组织除外)不表达，而在多种肿瘤组织中呈周期依赖性的表达〔11〕。

Survivin通过抑制细胞色素C从线粒体的释放从而在上游就阻断了凋亡信号的传导；Survivin能够阻止Caspase-9前体构象的改变，进而阻止下游Caspases分子前体蛋白的分解，且Survivin可与Caspase-3和Caspase-7结合并抑制其活性，进而抑制细胞凋亡〔12〕。本研究结果提示TMP诱导HeLa细胞凋亡、抑制其增殖，与其降低抗凋亡蛋白p-Bad和Survivin表达有关。

4参考文献

1李金柱，李伟.川芎嗪的结构改造及其生物活性研究进展〔J〕.中国实用医药，2008；3(1)：137-8.

2姜宏，施广飞，朱珠.川芎嗪对心血管作用研究进展〔J〕.中国临床药理与治疗学，2007；12(5)：484-6.

3张振玉，王祟文，祝金泉，等.川芎嗪及联用化疗药物对胃癌细胞杀伤作用的研究〔J〕.中国现代医学杂志，2009；9(1)：68-9.

4谢佐福，沈世仁.川芎嗪和羟基脲对阿霉素K562细胞株DNA合成的影响〔J〕.中华医学杂志，2008；73(9)：559-60.

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7刘宝瑞，徐修礼，刘文超，等.4种中药制剂对人肺癌A549细胞增殖的影响〔J〕.中国药理学通报，2006；18(1)：94-6.

8李隆玉，李诚信.宫颈癌的预防与普查〔J〕.中国实用妇科杂志，2009；19：151.

9何家璇，薛荣亮.Bad 蛋白对细胞凋亡的调控作用〔J〕.医学综述，2007；13(3)：161-3.

10Henshall DC，Ara KIT，Schinkler CK，etal.Activation of bcl-2-associated death protein and counter-response f Akt within ceu populations during seizure-induced neuronal death〔J〕.J Neurosci，2009；22(19)：8458-65.

11谢平，阮秋蓉，李军川.Survivin，Bcl-2在乳腺癌中的表达及意义〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2004；13(2)：147-50.

12谢海洋，刘邕波.Caspase-3及Survivin与心肌细胞凋亡的研究进展〔J〕.临床医学工程，2014；21(1)：124-5.

〔2015-10-25修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目(H2015074)；黑龙江省卫生厅科研项目(2009-336)；黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(1252G059)；佳木斯大学科技重点项目(Sz2011-009)；佳木斯大学大学生创新创业训练计划项目(201510222026)

通讯作者：柳朝阳(1971-)，男，硕士，副主任医师，主要从事肿瘤干细胞和神经内分泌免疫研究。

〔中图分类号〕R285.5;R73-36

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2605-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.016

1佳木斯大学医政管理处2佳木斯大学附属第一医院

3佳木斯大学2014级免疫学硕士

第一作者：张涛(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中草药抗肿瘤及肿瘤免疫机制方面的研究。