抗纤软肝胶囊对肝纤维化大鼠肝组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

刘黎明　张建军　胡东辉

(湖北中医药大学，湖北　武汉　430065)

抗纤软肝胶囊对肝纤维化大鼠肝组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

刘黎明张建军1胡东辉1

(湖北中医药大学，湖北武汉430065)

〔摘要〕目的探讨抗纤软肝胶囊对肝纤维化大鼠肝组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。方法66只雄性Wistar大鼠，随机数字表法中选取66个数字依大小排列，前12个为正常组，中36个为模型组，后18个为干预组，通过腹腔注射四氯化碳(CCl4)法制备大鼠肝纤维化模型，应用苏木素-伊红(HE)染色和Masson三色染色观察肝组织形态变化，免疫组化法检测Bax和Bcl-2蛋白表达。结果三组羟脯氨酸(Hyp)含量差异显著(P<0.05)，其中模型组和干预组高于正常组，模型组高于干预组(P<0.05)。免疫组化染色显示Bax蛋白主要分布在肝细胞质、Bcl-2蛋白主要分布在肝纤维间隔和汇管区。三组Bax、Bcl-2蛋白表达差异显著(P<0.05)，其中正常组和干预组低于模型组，正常组低于干预组(P<0.05)，三组Bax/Bcl-2比值统计学差异(P>0.05)。结论抗纤软肝胶囊可能降低肝细胞Bax和Bcl-2蛋白表达，减轻肝损伤。

〔关键词〕抗纤软肝胶囊；肝纤维化；Bax；Bcl-2蛋白

肝纤维化是各种慢性肝病的病理基础，由各种致病因子导致肝内结缔组织异常增生，文献显示肝纤维化严重程度与肝细胞凋亡增加，星状细胞活化增加、凋亡减少相关联〔1〕。B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)、Bax蛋白的表达变化决定了肝细胞、肝星状细胞(HSC)凋亡，进而影响纤维化的进程〔2〕。抗纤软肝胶囊是一种中药制剂，研究发现可能在肝纤维化治疗方面具有一定效果〔3〕。本文旨在研究抗纤软肝胶囊对肝纤维化大鼠肝组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。

1资料与方法

1.1动物及分组选取清洁级Wistar雄性大鼠66只，购自武汉大学动物实验中心，合格证书：医动字第09-012号，体重180～200〔平均(190.58±2.35)〕g，同时购买配套大鼠饲料4袋。将所有大鼠用数字编号，随机数字表法选取66个数字，按照大小排列，前12个为正常组，中36个为模型组，后18个为干预组。

1.2试剂及药物500 ml精制四氯化碳(CCl4)试剂购自欧陆科仪(中国)有限公司，橄榄油购自中国苏格拉蒂橄榄油有限公司，Bcl-2抗体和Bax 抗体均购自英国艾美捷科技有限公司，SASC(Strept Avidin-Biotin Complex)试剂盒购自武汉博士德生物制品公司，大鼠羟脯氨酸(Hyp)试剂盒购自上海酶联生物研究所。抗纤软肝胶囊购自湖北省中医院(鄂药制字Z20113151，成分：土鳖虫10 g，鳖甲10 g，茵陈蒿20 g，丹参30 g，三七6 g，桃仁10 g，当归10 g，莪术10 g，炮山甲6 g，白术10 g，薏苡仁20 g，黄芪10 g。

1.3研究方法

1.3.1动物肝纤维化模型制备和肝标本制备Wistar雄性大鼠66只,正常喂养1 w，正常组等渗盐水腹腔注射(0.2 m1/100 g)，2次/w，共8 w，同时按每100 g体质量2 ml给予等渗盐水灌胃，1次/d，共8 w，观察至14 w；模型组和干预组以30%CCl4橄榄油溶液(0.2 ml/100 g)腹腔注射，2次/w，共8 w，CCl4造模同时按每100 g体质量2 ml给予等渗盐水灌胃，1次/d，共8 w，停CCl4观察至14 w(逆转6 w)，其中干预组造模同时按大鼠体质量2 ml/100 g给予含抗纤软肝胶囊生药0.046 g/ml药液灌胃，1次/d，共8 w。干预组分别于第4、6、8周末隔夜空腹处死大鼠各6只；正常组和模型组分别于第4、6、8、10周(逆转2 w)、12 w(逆转4 w)、14 w(逆转6 w)末隔夜空腹处死正常组各2只、模型组各6只大鼠，留取血清；迅速取部分肝组织以4%中性甲醛固定，用于肝组织病理及免疫组织化学染色观察。

1.3.2肝组织Hyp测定和组织学观察精确称取肝脏组织湿重30～100 g放入试管中，加入水解液1 ml，混匀加盖后95℃水解20 min，配置肝组织水解液，调节pH值6.0～6.8，同时设定空白管、标准管等，严格按照试剂盒要求步骤操作。

取适量大鼠肝组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，制作肝脏组织切片，利用苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色，倒置显微镜10倍下观察细胞形态或者改变等，并且观察肝纤维化情况。

1.3.3Bax和Bcl-2蛋白表达测定将经过石蜡包埋肝组织进行切片，厚度5 μm，然后进行Bax和Bcl-2免疫组化染色和SABC法显示Bax和Bcl-2蛋白分布，按照SABC试剂盒要求步骤严格进行。光镜下观察肝组织病变、Bax和Bcl-2蛋白表达分布，免疫组化染色阳性出现棕黄色颗粒和线性沉积于细胞质、间隔等，Bax和Bcl-2蛋白阳性表达以已确诊Bcl组织为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)为一抗阴性对照，每张切片选取5个视野(400倍)，利用形态分析软件分析阳性面积所占比例，取平均值。

1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行方差分析和LSD-t检验。

2结果

2.1肝组织Hyp测定和组织学观察正常组Hyp为(0.23±0.08)μg/ml，模型组为(0.45±0.21)μg/ml，干预组为(0.32±0.06)μg/ml，差异显著(F=3.565，P=0.035)，其中模型组和干预组均高于正常组(t=4.564、3.342,P=0.021、0.038)，模型组高于干预组(t=3.876，P=0.032)。

组织学观察：HE染色显示正常组织结构清楚，细胞形态完整，无明显凋亡现象；模型组组织结构破坏，肝细胞脂质变性，具有明显纤维组织增生；干预组组织结构受到破坏，肝细胞脂质变性，纤维组织增生，但是均无模型组严重。Masson三色染色显示正常组仅显示少量蓝色纤维；模型组蓝色纤维明显增加，并且相互交织形成纤维间隔；干预组蓝色纤维有所减少，纤维多分布与血管周围和汇管区。

2.2Bax和Bcl-2蛋白表达免疫组化染色显示Bax在正常组肝组织中央静脉以及肝窦少量表达，为浅棕黄色；模型组主要在肝细胞质呈现深棕黄色，在肝纤维间隔和汇管区浅黄色。Bcl-2在正常组细胞质、中央静脉底表达，为浅棕黄色；在肝纤维间隔和汇管区高表达，为深棕黄色。三组Bax、Bcl-2蛋白表达差异显著(P<0.05)，其中正常组和干预组均低于模型组，正常组低于干预组(P<0.05)，三组Bax/Bcl-2比值差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　三组Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较

与模型组相比：1)P<0.05，与正常组相比：2)P<0.05

3讨论

肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生〔4〕。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化，严重损伤肝脏功能〔4〕。肝纤维化是肝脏损伤、肝脏炎症、肝细胞坏死、HSCs激活等的中心环节〔5〕。HSCs是肝脏的一种非实质细胞，位于Disse间隙内，是肝纤维化时大量细胞外基质(ECM)及胶原过多产生的主要来源细胞，其激活和增殖在肝纤维化发生过程中起关键作用〔6〕；静止的HSCs被激活后大量增殖，表达各种细胞外信号转导通路蛋白〔7〕；分泌大量细胞因子、产生金属蛋白酶抑制物，诱导生成〔8〕；若病因持续存在，导致肝小叶结构和血液循环异常，诱发肝硬化发生。目前肝移植是严重肝病唯一有效的治疗措施，但肝纤维化在某种程度上可逆转，抑制HSCs 激活、促进其凋亡，是肝纤维化恢复的主要机制。

肝细胞凋亡主要有内源性途径和外源性途径〔9〕，这两种途径都伴随着线粒体结构和功能的改变，调节肝细胞发生凋亡的重要蛋白为Bcl-2家族。Bcl-2和Bax分别作为Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡的代表蛋白，在细胞凋亡机制中起着重要作用〔10〕。Bax诱导细胞凋亡表达与定位改变相关，正常细胞中Bax主要定位于细胞质内〔11〕，受到损伤后，Bax将重新定位，促使线粒体孔道形成，引起细胞色素C的释放，从而诱导细胞凋亡。细胞凋亡时，Bax通过破坏线粒体膜的完整性发挥作用，而Bcl-2则在线粒体外膜发挥作用，以维持膜的完整性。

Hyp在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中含量极少，其他蛋白中基本不存在，胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨、血管等处，因此Hyp可以较好反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。本研究结果说明给予干预大鼠抗纤软肝胶囊后大鼠肝细胞过度凋亡情况有所改善，并且Bcl-2蛋白表达降低，可以诱导HSCs凋亡等。抗纤软肝胶囊进入可能激活线粒体依赖凋亡途径，促使线粒体膜电位降低，促使Bcl-2家族蛋白活化，通过导致Bax、Bcl-2蛋白表达降低发挥作用。抗纤软肝胶囊可能通过降低肝细胞Bax和Bcl-2蛋白表达途径，尤其是在肝细胞质、纤维间隔、汇管区等区域Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax表达水平动态变化的影响，减少肝细胞凋亡和促进HSC细胞凋亡，减轻肝损伤，为研究抗肝纤维化的作用机制、临床治疗提供理论依据。

4参考文献

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2骆稚平.抗纤软肝胶囊联合西药治疗乙型肝炎肝硬化随机平行对照研究〔J〕.实用中医内科杂志,2013;27(2):100-1.

3王礼凤,刘莉君,孙守才,等.姜黄素对实验性肝纤维化大鼠肝组织Bel-2和Bax表达的影响〔J〕.现代中医药,2011;31(1):55-6.

4冯文强,张松,丁美玲,等.SIRT1在小鼠肝纤维化中的作用及转录差异基因分析〔J〕.现代生物医学进展,2015;15(9):1608-12,1631.

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7张雪娇,郑仕中,陆茵,等.线粒体在肝细胞凋亡中的作用及中药对其保护作用〔J〕.中草药,2011；42(7):1141-5.

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9Park JH,Lee MK,Yoon J.Gamma-linolenic acid inhibits hepatic PAI-1 expression by inhibiting p38 MAPK-dependent activator protein and mitochondria-mediated apoptosis pathway〔J〕.Apoptosis,2015;20(3):336-47.

10Yu FX,Teng YY,Zhu QD,etal.Inhibitory effects of capsaicin on hepatic stellate cells and liver fibrosis〔J〕.Biochem Cell Biol,2014;92(5):406-12.

11Chen G,Wang Y,Li M,etal.Curcumol induces HSC-T6 cell death through suppression of Bcl-2:involvement of PI3K and NF-κB pathways〔J〕.Eur J Pharm Sci,2014;65(1):21-8.

〔2015-06-24修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目：湖北省2011年度科研项目(No.JX5B39)

通讯作者：胡东辉(1984-)，男，硕士，主治医师，主要从事中西医结合肝病方面的研究。

〔中图分类号〕R57

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2615-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.021

1湖北省中山医院肝病科

第一作者：刘黎明(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事中西医结合肝病方面的研究。