咖啡因对睡眠剥夺老龄小鼠学习记忆及海马抗氧化能力和胆碱能系统的影响

李祖成　亢泽春　李淑翠　王垣芳

(滨州医学院烟台附属医院，山东　烟台　264032)

1滨州医学院

咖啡因对睡眠剥夺老龄小鼠学习记忆及海马抗氧化能力和胆碱能系统的影响

李祖成亢泽春1李淑翠1王垣芳1

(滨州医学院烟台附属医院，山东烟台264032)

〔摘要〕目的探讨咖啡因对老龄睡眠剥夺小鼠学习记忆及海马抗氧化能力和胆碱能系统的影响。方法昆明种雄性小鼠50只随机分为正常睡眠组、睡眠剥夺模型组和咖啡因低、中、高剂量组(5,10,20 mg/kg)，采用小平台水环境法进行睡眠剥夺连续72 h，同时灌胃给药2次/d，正常睡眠组和模型组小鼠在相同时间灌服等体积的生理盐水；各组小鼠每天灌胃1 h后进行Morris水迷宫试验测试学习记忆能力，睡眠剥夺72 h后测定海马组织中和乙酰胆碱含量、和乙酰胆碱酯酶(AChE)的活力。结果与模型组比较，咖啡因各剂量组小鼠Morris水迷宫定位航行试验逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)，空间探索试验穿越原平台位置的次数显著增多(P<0.05)，小鼠海马组织中AChE含量增加、MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，AChE和SOD活力增强(P<0.05，P<0.01)，GSH-Px活力无明显变化(P>0.05)。结论咖啡因可以改善睡眠剥夺小鼠的学习记忆功能，其机制可能与增强海马抗氧化能力及胆碱能系统功能有关。

〔关键词〕咖啡因；睡眠剥夺；记忆；海马；胆碱能系统；抗氧化能力

老年人睡眠障碍和记忆障碍的发生率都很高，而睡眠障碍又可导致学习记忆功能下降〔1〕。而在睡眠障碍时，人们通常饮用咖啡以振奋精神和维持警觉。咖啡因是咖啡中的主要活性成分，属甲基黄嘌呤类生物碱，具有兴奋中枢神经系统、助消化、强心利尿等作用。研究表明，长期摄入咖啡或咖啡因可以改善认知功能，并增强脑内抗氧化酶的活性〔2,3〕。然而，关于咖啡因对睡眠剥夺导致记忆障碍的影响及机制的研究尚鲜见报道。本实验通过Morris水迷宫试验观察咖啡因对睡眠剥夺24、48 h和72 h小鼠学习记忆功能的影响，并通过检测海马抗氧化能力及胆碱能系统功能，探讨咖啡因对睡眠剥夺小鼠学习记忆的影响及其机制。

1材料与方法

1.1动物、药品、试剂及主要仪器昆明种雄性老龄小鼠(12个月龄)，体质量(40±2)g ，由山东绿叶制药有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2009 0009。无水咖啡因(山东新华制药股份有限公司，批号09111449)，乙酰胆碱酯酶(AChE)测试盒(批号20110420)、乙酰胆碱(ACh)测试盒(批号20110423)，均购于南京建成生物工程研究所。Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所研制)；EL204电子分析天平(METTLER-TOLEDO仪器有限公司)；超低温冰箱(美国Thermo公司)；XB 70型制冰机(GRANT公司)；5810R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；微量加样器(德国Eppendorf公司)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)；SYNERGY HT型酶标仪(BIO-TEK公司)。

1.2分组、造模与给药采用Morris水迷宫筛选出定位航行试验成绩相近的雄性小鼠50只，随机分为5组：正常睡眠组、睡眠剥夺模型组和咖啡因高、中、低剂量组。采用小平台水环境法〔4〕对模型组和咖啡因各剂量组小鼠进行睡眠剥夺，即在每个鼠笼中央设置一个直径2.5 cm、高4.0 cm的平台，鼠笼内注水，水面低于平台1 cm，水温保持(20±0.5)℃。将1只小鼠放置在平台上，小鼠可以在平台上站立，也可自由摄取食物和水，但当进入快速眼动(REM)睡眠时，由于骨骼肌松弛可使小鼠掉入水中而惊醒，造成REM剥夺使小鼠不能入睡，连续72 h。正常睡眠组小鼠单笼喂养，自由睡眠，室内温度控制在(20±0.5)℃。咖啡因高、中、低剂量组分别给予咖啡因20，10，5 mg/kg灌胃，正常睡眠组和睡眠剥夺模型组在相应时间点给予等容量的生理盐水灌胃。

1.3Morris水迷宫法测试小鼠学习记忆能力〔5〕

1.3.1Morris水迷宫测试装置Morris水迷宫由直径120 cm的圆形水池、高50 cm的平台和记录系统三部分组成。水池水深25 cm(高出平台1 cm)，水温控制在(23±0.5)℃，在水池边缘上等距离设东、西、南、北四个标记点，将水池等分为4个象限，平台置于第一象限。摄像机安置于水池上方1.5 m 处并与计算机连接，利用记录系统对小鼠的活动进行全程跟踪，并记录游泳轨迹、游泳路径长度、找到平台所需时间(即逃避潜伏期)。实验室挂窗帘避光，每次试验保持水迷宫外所有参照物保持不变。

1.3.2定位航行试验(PNT)各组小鼠在每天给药1 h后进行定位航行试验。按第Ⅰ至第Ⅳ象限的顺序将小鼠面壁放入水池中，每次入水间隔时间为20 min。系统自动录像记录小鼠入水后找到并爬上平台(停留时间>3 s)的游泳时间即逃避潜伏期(LE)、游泳路程和游泳速度。每次观察时间为60 s，如果在60 s内动物未能找到平台，则由实验者将其引导至平台，并在站台上停留10 s，潜伏期记为60 s。将每天4个象限的逃避潜伏期和游泳路程的平均数分别作为当天的成绩。逃避潜伏期越短，表明学习记忆获得和巩固的能力越强。

1.3.3空间搜索试验(SPT)各组小鼠最后一次PNT后撤除平台，将小鼠从最后一次入水点面向池壁放入水中，使其在水迷宫中连续游泳，记录小鼠的游泳路程和60 s内穿越原平台所在位置的次数作为空间搜索试验的成绩。穿越原平台的次数越多，表明小鼠对空间位置的短期记忆和判断能力(即空间探索能力)越强。

1.4海马胆碱能系统功能检测水迷宫测试结束后，将小鼠迅速断头取脑，于冰面上分离两侧海马，称重，按重量/体积比1∶9加入试剂盒指定的溶液液，制成约10%匀浆，3 000 r/min 4℃离心10 min，留上清液，采用化学比色法测定ACh含量和AChE活力。严格按照试剂盒说明书进行操作。

2结果

2.1咖啡因对睡眠剥夺小鼠逃避潜伏期的影响与正常睡眠组比较，模型组小鼠睡眠剥夺24 h、48 h和72 h后PNT逃避潜伏期均延长(P<0.05)；与模型组比较，咖啡因各剂量组小鼠睡眠剥夺24 h、48 h和72 h后逃避潜伏期均缩短(P<0.05)。见表1。

2.2咖啡因对睡眠剥夺小鼠游泳路程的影响 与正常睡眠组比较，模型组小鼠睡眠剥夺24 h、48 h和72 h后定位航行试验游泳路程延长(P<0.05)；与模型组比较，咖啡因各剂量组小鼠睡眠剥夺48 h和72 h后游泳路程均缩短(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1　咖啡因对小鼠Morris水迷宫试验逃避潜伏期及对定位航行试验游泳路程的影响±s)

与正常睡眠组比较：1)P<0.05；与睡眠剥夺模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.01，下表同

2.3咖啡因对睡眠剥夺小鼠空间探索能力的影响 与正常睡眠组比较，模型组小鼠睡眠剥夺72 h后空间探索试验穿越平台次数减少(P<0.05)；与模型组比较，咖啡因各剂量组小鼠睡眠剥夺72 h后空间探索试验穿越平台次数增多(P均<0.05)，以咖啡因高、中剂量组为明显(P<0.01)。与正常睡眠组比较，模型组小鼠睡眠剥夺72 h后游泳路程缩短(P<0.05)；与模型组比较，咖啡因各剂量组小鼠睡眠剥夺72 h后游泳时间均延长(P均<0.05)，以咖啡因高、中剂量组为明显(P<0.01)。见表2。

表2　咖啡因对睡眠剥夺小鼠空间探索能力的影响±s)

2.4咖啡因对睡眠剥夺小海马ACh含量及AChE活力的影响与正常睡眠组比较，模型组小鼠睡眠剥夺72 h后海马组织ACh含量降低、AChE活力增高(P<0.05)。与模型组比较，咖啡因各剂量组小鼠海马组织ACh含量增加、AChE活力降低(P均<0.05)，以咖啡因高剂量组更为显著。见表3。

表3　咖啡因对睡眠剥夺小鼠海马ACh含量及

3讨论

研究表明，长时间的睡眠缺失或睡眠剥夺对人和动物的短时记忆、记忆的保持和巩固、长时记忆的形成均有不良影响〔6,7〕。小平台水环境法是研究SD的常用方法，该方法主要剥夺动物的(REM)睡眠〔4〕。REM睡眠对记忆的获得具有重要意义，REM睡眠剥夺可损害学习记忆功能〔8〕。本实验结果表明小鼠睡眠剥夺24～72 h后学习记忆能力下降。在睡眠剥夺的同时应用咖啡因5～20 mg/kg，可使小鼠睡眠剥夺24 h、48 h和72 h后定位航行试验逃避潜伏期缩短、游泳路程缩短，且空间探索试验穿越平台次数增加，表明咖啡因可以改善睡眠剥夺小鼠的学习记忆功能。

海马是与学习记忆有关的重要脑区，多年来已经成为研究学习记忆机制的重要解剖结构。研究证实，脑内投射至海马结构的胆碱能系统与学习记忆有关，海马内丰富的ACh递质是促进学习记忆的重要递质〔9,10〕，AChE是ACh的水解酶，其活性直接影响海马ACh水平。本实验结果表明睡眠剥夺导致了小鼠海马胆碱能系统功能减弱，这与文献报道一致〔11〕。在睡眠剥夺的同时应用咖啡因5～20 mg/kg，可使小鼠海马ACh含量增加、AChE活力降低，提示咖啡因可以使睡眠剥夺小鼠海马胆碱能系统的功能增强。

目前认为，睡眠剥夺作为一种高强度的应激可对大脑皮质和海马产生氧化应激损伤〔12，13〕。本实验结果提示咖啡因对睡眠剥夺引起的小鼠海马氧化应激反应具有抑制作用。

综上，适量的咖啡因可以改善睡眠剥夺老龄小鼠的学习记忆能力，其机制可能与增强海马胆碱能系统的功能有关。

4参考文献

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〔2014-12-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：山东省自然科学基金项目(No.ZR2011HM059)；烟台市科学技术发展计划(No.2009168)

通讯作者：王垣芳(1963-)，女，教授，硕士，主要从事合成药物与天然药物生物学活性研究。

〔中图分类号〕R743

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2583-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.008

第一作者：李祖成(1962-)，男，副教授，硕士，主要从事神经生理学研究。