CXCL8/PI3K-Akt信号通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞血管生成拟态中的作用

安芳玲　和祯泉　马　芳　扈一楠　顾金海

(宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏　银川　750004)

CXCL8/PI3K-Akt信号通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞血管生成拟态中的作用

安芳玲和祯泉马芳扈一楠顾金海

(宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏银川750004)

〔摘要〕目的探讨CXCL8/PI3K-Akt信号转导通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞株U87MG和U251血管生成拟态中的作用。方法用氯化钴(CoCl2)模拟缺氧环境，将人脑胶质瘤细胞株U87MG和U251置中培养。分别加入PI3K-Akt信号通路激动剂CXCL8及PI3K-Akt信号通路抑制剂LY294002干预48 h，体外成管实验检测各组细胞成管能力；Western印迹检测各组Akt、P-Akt蛋白的表达情况。结果缺氧可导致U87MG细胞和U251细胞形成的管腔样结构明显增加，Akt蛋白的磷酸化活化表达显著增加(P<0.05)。加入CXCL8干预可使管腔样结构直径进一步增长，而加入LY294002干预48 h则可使其管腔样结构在数量和直径上显著少于缺氧组(P<0.05)。CXCL8能够有效激活Akt磷酸化，LY294002则显著抑制其磷酸化活化(P<0.05)，而总Akt蛋白表达无差异(P>0.05)。结论CXCL8/PI3K-Akt信号转导通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞株U87MG和U251血管生成拟态中发挥重要的促进作用，可望成为胶质瘤治疗有效靶点。

〔关键词〕人脑胶质瘤；血管形成拟态；CXCL8；PI3K-Akt

血管生成拟态(VM)作为一种不依赖于血管内皮细胞的肿瘤内管状网络模式，为抗肿瘤血管治疗提供了新的思路〔1〕。研究表明，缺氧是实体瘤微环境的最基本的特征之一，是由于肿瘤内血管结构和功能异常而导致的肿瘤细胞血供、氧供减少，以及肿瘤细胞的快速增殖而导致的肿瘤细胞氧耗增加〔2～4〕。这种状态可以改变肿瘤的生物学特性，导致肿瘤细胞的遗传不稳定性和侵袭力增加，以及对放化疗的抵抗性增强。血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管生成的主要因子，其产生受缺氧诱导〔5〕。在缺氧条件下VEGF能够促进VM的网络状结构的形成。磷脂酰肌醇-3激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号转导通路的活化广泛存在于各种类型的细胞中，并且在肿瘤细胞周期调控、增殖和分化等多种生命活动中起着至关重要的作用。本研究旨在以胶质瘤细胞系U87MG、U251为实验对象，氯化钴(CoCl2)模拟体外缺氧〔6〕，验证缺氧对胶质瘤细胞生物学特性的影响，并且研究其相关机制。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂人脑胶质瘤细胞U87MG、U251均购于上海市吉凯基因化学技术有限公司。DMEM培养基购自美国HyClone公司。人CXCL8购自美国Pepro Tech公司。PI3K通路特异性抑制剂 LY294002和二甲基亚砜(DMSO)均购自美国 Sigma 公司；兔抗人Akt(pan)(11E7)和Phospho-Akt(Thr308)/(244F9)单克隆抗体购自美国Cell Signal Technology公司，兔抗人GAPDH多克隆抗体(AB-P-R OO1)购自杭州贤至生物科技有限公司，荧光二抗Goat anti-Rabbit 926-32211购自美国li-cor公司。Western印迹相关试剂均购自南京凯基生物科技发展有限公司。BD基质胶购自美国Sigma公司，Transwell 小室购于美国Corning 公司。钙黄绿素购自AAt bioquest。

1.2方法

1.2.1细胞培养采用含有10%胎牛血清、1%氨苄青霉素和链霉素的DMEM培养基培养人胶质瘤细胞U87MG和U251，置于37℃，体积分数为5% CO2培养箱内进行常规培养，取对数生长期细胞进行实验，CoCl2用无菌三蒸水配成浓度为50 mmol/L的母液，过滤后分装，避光保存于-20℃，使用前用培养基稀释成所需浓度的CoCl2工作液。实验分为对照组，缺氧组(培养基中加入 CoCl250 mm/L)，缺氧组加入外源性CXCL8(50 ng/ml)，缺氧组加入抑制剂LY294002(50 μmol/L)。U251细胞的处理方法相同。各组细胞分别接种培养48 h后，进行各指标检测。

1.2.2胶质瘤细胞体外拟血管形态观察BD基质胶在冰水浴中过夜融化，用预冷的枪头吸取 50 μl Matrigel加入到水平放置在冰盒上的96孔板内，均匀铺平后将96孔板放入37℃培养箱内孵育1 h使胶凝固。用胰蛋白酶消化U87MG和U251细胞，离心，弃上清后用DMEM重悬，调整细胞终浓度为1×104个/孔接种于预先铺好Matrigel的96孔板内，每孔100 μl，放置细胞培养箱内。12 h后观察各组处理细胞能否在凝胶上形成网状结构。

1.2.3Western印迹检测U87MG和U251细胞在6孔培养板中培养，至70%～80%汇合率时，提蛋白进行Western印迹实验。48 h后拿出培养的各组细胞，用冷PBS洗2次，加入配好的细胞裂解液(全过程在冰上操作)，置于4℃摇床充分裂解15 min，然后用细胞刮子刮下细胞，吸入到1.5 ml EP管，15 000 r/min，离心15 min，吸取上清即为所需全蛋白，-80℃保存。用来实验的蛋白用BCA法测定蛋白浓度，煮蛋白98℃ 5 min。然后取蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，用TBST配制的牛奶封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜(Akt，P-Akt，GAPDH稀释比分别为1∶500，1∶2 000，1∶3 000)。过夜后用TBST洗膜5次，每次5 min，之后用荧光二抗(1∶5 000)避光室温孵育1 h，TBST洗膜5次后用奥德赛(ODYSSEY CLx)曝光。扫描灰度并计算蛋白相应的表达量。

1.3统计学分析采用SPSS17.0软件行方差分析。

2结果

2.1缺氧对胶质瘤细胞VM的影响经Calcein 染色，镜下观察，对照组常氧条件下U87MG细胞生长序列紊乱，无明显规律，但能发现少数的网状结构；缺氧组细胞相互连接，融合形成网状结构，呈单个环或多个环连接的网络样结构。对照组管腔结构的长度为(45.113±2.721)μm，而缺氧组为(200.161±2.148)μm，组间比较差异显著(P<0.05)。U251细胞显示出相似的结果，对照组管腔结构的长度为(45.113±2.721)μm，而缺氧组为(110.315±2.633)μm，组间比较差异显著(P<0.05)。见图1，图2。

2.2激动剂CXCL8对胶质瘤细胞体外VM的增强作用当缺氧组加入激动剂CXCL8(50 ng/ml)后，表现为更多细胞之间互相融合，连接成网状结构，形成管腔样结构，对照组管腔结构的长度为(45.113±2.721)μm，而缺氧加CXCL8组为(157.206±1.993)μm，组间比较差异显著(P<0.05)。U251细胞显示出相似的结果，对照组管腔结构的长度为(45.113±2.721)μm，而缺氧加CXCL8组为(88.075±1.997)μm，组间比较差异显著(P<0.05)。结果说明CXCL8能够增强胶质瘤细胞体外VM的现象。见图1，图2。

2.3抑制剂LY294002对胶质瘤细胞体外血管生成拟态的抑制作用当缺氧组加入抑制剂LY294002(50 μmol/L)后，细胞管腔样结构减少，呈无序列紊乱生长。对照组管腔结构的长度为(45.113±2.721)μm，而缺氧加LY294002组为(244.763±2.011)μm，组间比较差异显著(P<0.05)。U251细胞显示出相似的结果，对照组管腔结构的长度为(45.113±2.721)μm，而缺氧加LY294002组为(206.673±1.780)μm，组间比较差异显著(P<0.05)。结果说明LY294002能够抑制胶质瘤细胞体外血管生成拟态的现象。见图1，图2。

A：对照组；B：缺氧组；C：缺氧+CXCL8组；D：缺氧+LY294002组；下图同图1　胶质瘤细胞U87MG拟血管形态形成检测(×100)

图2　胶质瘤细胞U251拟血管形态形成检测(×100)

2.4缺氧对P-Akt表达情况的影响Western印迹结果显示，CoCl2处理的缺氧组与对照组比较，Akt的表达无显著差异(P>0.05)，而P-Akt的表达明显高于对照组(P<0.05)。U251细胞显示出相似的结果。结果说明缺氧能够使得胶质瘤细胞P-Akt表达增加。见图3。

2.5抑制剂LY294002和激动剂CXCL8分别对P-Akt表达的影响Western印迹结果显示，当缺氧组加入CXCL8后，相比缺氧组，Akt的表达无显著差异(P>0.05)，而P-Akt表达明显增强(P<0.05)。而缺氧组加入LY294002后，相比缺氧组，Akt的表达无显著差异(P>0.05)，而P-Akt表达降低(P<0.05)。U251细胞也表现出相似的结果。结果说明，当加入CXCL8后，P-Akt的表达增加，CXCL8对胶质瘤细胞VM的生成有促进作用，而即LY294002对胶质瘤细胞VM有减弱作用。见图3。

图3　Western印迹检测胶质瘤细胞U87MG和U251中P-Akt的表达

3讨论

VM 由于没有内皮细胞的屏障作用，不但可以为肿瘤的生长提供良好的血液灌注，且有利于肿瘤细胞的转移〔7～9〕。VEGF能够促使血管内皮细胞有丝分裂并最终形成新生血管，更是刺激肿瘤血管生成的最强的细胞因子。本实验在铺有BD基质胶的培养板上培养，它有利于胶质瘤细胞形成毛细血管管腔样结构；其次，这个过程要有促血管生成因子的存在，这就必须有促进胶质瘤细胞分泌某些因子或添加血管生长因子。钴通过细胞内离子置换使亚铁螯合酶失活，从而达到抑制细胞对氧的利用，最终达到常氧下诱导细胞缺氧的效果。缺氧会诱导胶质瘤细胞分泌一些生长因子包括 VEGF、HGF、IGF 等对抗凋亡，其中以VEGF最重要。恶性胶质瘤是中枢神经系统中最常见的VEGF高表达并且富含大量新生血管的脑肿瘤〔10〕。VEGF不仅可以对胶质瘤细胞的凋亡起到对抗作用〔11〕。VEGF的高表达与肿瘤拟形成的微血管密度、恶性程度以及患者的预后不良等有着密切的关系〔12〕。

近期研究显示，VEGF在神经系统中的作用是由包括PI3K依赖活化的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶、Akt(又名PKB)在内的抗凋亡途径介导〔13〕。PI3K和PI3K/Akt信号通道能够被一些神经营养因子和其他的生物学刺激而激活〔14〕，它涉及转录、细胞凋亡、增殖、迁移和血管发生等多种过程〔15〕。CXCL8介导的Ser/Thr蛋白激酶Akt作为PI3K/Akt信号通路的重要靶点，在多种恶性肿瘤中均可发现其异常活化。因此，通过调节Akt表达可以调整胶质瘤细胞拟血管形态形成的平衡，从而达到抑制肿瘤生长及侵袭等的目的。LY294002 能够显著地抑制 Akt的磷酸化，是PI3K-Akt 信号传导通路的特异性抑制剂。由于LY294002的分子量小，能够轻易地穿过血脑屏障，目前已经成为该通路在胶质瘤发生发展中作用机制的研究热点〔16〕。

本实验发现，缺氧造成VEGF的高表达，VEGF又通过一种信号途径使得P-Akt 的表达量增加。因为CXCL8能够直接作用于PI3K-Akt信号通路，使得Akt磷酸化，因此，在缺氧组加入激动剂CXCL8后，胶质瘤细胞拟血管形态的形成能力升高，而P-Akt的表达也较缺氧组增加，说明CXCL8在拟血管形态形成的过程中起着一定的作用。同时，我们在缺氧组加入了PI3K-Akt信号通路的抑制剂LY294002，结果发现胶质瘤细胞拟血管形态能力减弱，P-Akt的表达量也降低。因此我们推测，VM形成可能是肿瘤生长过程中应对缺氧等刺激因素的一种方式。快速生长的肿瘤需要氧供，缺氧促使有可塑性的肿瘤细胞互相连接，形成拟态血管，给肿瘤组织供氧，肿瘤细胞高表达的 VEGF可能在这种细胞自身变形形成拟态血管过程中起一定促进作用，即肿瘤早期从拟态血管获得血供，生长加速，高表达的 VEGF进一步促新生血管形成，而且由于其结构特殊性使肿瘤细胞与血流之间的屏障减弱，肿瘤细胞进入血液循环的可能性加大，增高转移概率，符合临床研究得出的存在VM的肿瘤患者病情进展快、转移早、愈后差的结论。而其机制可能是缺氧导致VEGF的表达量增加，过表达的VEGF刺激胶质瘤细胞分泌CXCL8，从而激活PI3K-Akt信号通路，使得胶质瘤细胞拟血管形态能力增加，这或许是胶质瘤细胞拟血管形态形成的原因之一。

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〔2015-12-03修回〕

(编辑徐杰)

Roles of CXCL8/PI3K-Akt signaling pathway in vascular mimicry induced by hypoxia of human glioma cell line U87MG and U251

AN Fang-Ling，HE Zhen-Quan，MA Fang,et al.

Ningxia Key Laboratory of Cerebrocranial Diseases，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia,China

【Abstract】ObjectiveTo study the roles of CXCL8/PI3K-Akt signaling pathway in vascular mimicry induced by hypoxia of human glioma cell.MethodsThe chemical hypoxia was induced by incubation of U87MG cells and U251 cell with cobalt chloride.After the two cells were treated with CXCL8(the activator of PI3K/Akt)and LY294002(the inhibitor of PI3K/Akt)for 48 h，the tube formation of tumor cells were tested by transwell chamber test and vascular mimicry experiment.Western blot assay was employed to determine the expressions of Akt and p-Akt.ResultsThe formed tubes of U87MG cells and U251 cells were significantly increased by incubated with cobalt chloride,either did the expression level of p-Akt.Compared to hypoxia group，there were more formed tubes after CXCL8 treatment,while less formed tubes after LY294002 treatment.Western blot indicated that the expression of p-Akt at protein level was decreased(P<0.05)，while STAT3 protein had no difference among each group(P>0.05).ConclusionsCXCL8/PI3K-Akt signaling pathway plays an important roles in vascular mimicry induced by hypoxia of human glioma cells in vitro，so it could be expected as a potential target for the treatment of glioma.

【Key words】Glioma;Vascular mimicry;CXCL8;PI3K-Akt

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81160312)；宁夏医科大学校级科研项目(XM201314)

通讯作者：顾金海(1974-)，男，博士后，副教授，硕士生导师，主要从事颅脑疾病及信号通路的研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2312-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.002

第一作者：安芳玲(1990-)，女，硕士，主要从事人脑胶质瘤信号通路研究。