活血荣络片对AD模型小鼠AchE和ChAT表达的影响*

李　珊　胡　华　　周德生（.湖南中医药大学，湖南长沙40007；.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙40007）



活血荣络片对AD模型小鼠AchE和ChAT表达的影响*

李珊1胡华2△周德生2
（1.湖南中医药大学，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

【摘要】目的观察活血荣络片对阿尔茨海默病（AD）小鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（AchE）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）表达的影响。方法将50只APP/PS1双转基因AD模型小鼠随机分为模型组、低剂量活血荣络片组、中剂量活血荣络片组、高剂量活血荣络片组、多奈哌齐组，每组10只。同期将同月龄的10只KM小鼠作为正常组。每天灌胃1次，连续治疗2个月。治疗结束后，取各组小鼠脑组织，采用Western Blot检测AchE和ChAT蛋白含量。结果与正常组相比，AD模型组小鼠脑组织AchE蛋白表达提高、ChAT蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组相比，低中高剂量活血荣络片组、多奈哌齐组脑组织AchE蛋白表达降低、ChAT蛋白表达增高（P＜0.01）；与多奈哌齐组比较，中、高剂量活血荣络片组降低AchE蛋白表达的变化无统计学意义（P＞0.05），而高剂量活血荣络片组提高ChAT蛋白的表达（P＜0.05）。结论活血荣络片可一定程度上抑制AD模型小鼠脑组织AchE蛋白的表达并促进ChAT蛋白的表达。

【关键词】活血荣络片阿尔茨海默病乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱转移酶

阿尔茨海默病（AD）极大地影响着人群的健康。近年来，随着急性脑卒中发病率的增加，也增加了AD的发病率，加快了疾病的进展，使AD成为脑血管意外后的主要后遗症之一［1］。目前AD确切病机尚不明确，暂无特效治疗方法，乙酰胆碱的缺失被认为是重要的病因。研究表明［2］AD患者脑内乙酰胆碱（Ach）水平下降迅速，乙酰胆碱的缺乏与认知功能障碍密切相关。本课题组前期研究显示，活血荣络片可一定程度上改善患者学习及记忆能力，并抑制AD小鼠脑组织β淀粉样蛋白（Aβ）的沉积。本研究在前期研究基础上，从乙酰能代谢角度探讨活血荣络片对AD模型小鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（AchE）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物KM小鼠，体质量（20±2）g，SPF级，鼠龄5月，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（湘）2011-0003。APP/PS1双转基因小鼠，体质量（20±2）g，SPF级，鼠龄5个月，雌雄各半，购自中国医学科学院实验动物研究所，许可证号：SCXK（京）2008-0025。APP/PS1双转基因AD模型小鼠随年龄的增加会出现类似AD的病理改变，是公认的研究AD防治的转基因动物模型［3］。小鼠均饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验中心，室温24～26℃，湿度55%～60%，光照时间8∶00～20∶00。自由饮水进食，定期更换垫料，适应性喂养1周后开始实验。

1.2试剂与仪器主要试剂包括鼠抗AchE单克隆抗体，鼠抗ChAT单克隆抗体，羊抗鼠二抗，RIPA蛋白裂解液（圣克鲁斯生物技术有限公司）；彩色预染蛋白marker，超敏化学放光显色试剂盒（江苏碧云天生物技术有限公司）；羊抗鼠二抗（美国vazyme公司）。主要仪器包括手术器械；-80℃冰箱；灌胃针、烧杯、量筒等；AE-240精密分析天平（瑞士Mettler公司）；MIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统（北航公司）；LEICADMLBZ型双目显微镜（德国LEICA公司）；DYY-6C电泳仪、DYCZ-24D垂直板电泳槽、DYCP-40C水平电转槽、WD-9405B水平摇床均购自于北京六一仪器厂；THZ-82A恒温摇床（金坛公司）；SP-752紫外可见分光光度计（上海spectrum公司）。

1.3实验药物活血荣络片由湖南中医药大学第一附属医院制剂科提供，湘药制字Z20080472，规格：0.35 g/片，100片/瓶，每片含生药量0.14 g。将药片放入蒸馏水中溶解，低、中、高剂量组分别配成0.275 g/kg（相当于生药量0.11 mg/kg）、0.55 g/kg（相当于生药量0.22mg/kg）、1.10g/kg（相当于生药量0.44 mg/kg）的药液。多奈呢齐片：陕西方舟制药有限公司，国药准字号H20030583，生产批号：130901，规格：5 mg/片，7片/盒。将药片放入蒸馏水中溶解，配成0.65 mg/kg的药液。以上药液放入冰箱中保存，给药前在室温下放置30min，摇匀后灌胃。

1.4分组与给药50只APP/PS1双转基因AD模型小鼠，随机分为模型组、低剂量活血荣络片组、中剂量活血荣络片组、高剂量活血荣络片组、多奈哌齐组，每组10只。同期将同月龄的10只KM小鼠作正常组。正常组、模型组予蒸馏水灌胃，低、中、高剂量活血荣络片组予相应剂量活血荣络片药液灌胃。多奈哌齐组予多奈哌齐药液灌胃。灌胃量按0.1 mL/10g给予，每天灌胃1次，下午4～5时执行，连续处理2个月（相当于AD早中期）。

1.5标本采集与检测治疗结束后取材，各组小鼠脑组织用液氮冰冻保存。组织匀浆后，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，配制12%分离胶，3%的浓缩胶，80V恒压电泳30min后，电压增加至120V恒压电泳60min；电泳结束后进行转膜，条件电压80V转膜2.5 h；5%脱脂奶粉封闭1 h；一抗4℃孵育过夜；二抗室温下孵育1～2h；洗膜4次，每次10min；向膜上均匀滴加ECL液，平稳地将显色板放入Image Quant 350化学发光系统，曝光显色；Image J软件分析灰度值。

1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示。所有资料进行正态性检验。符合正态分布者，多组比较采用单因素方差分析。不符合正态分布者，采用多个独立样本比较的秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组小鼠脑组织中AchE的含量比较见表1，图1。与正常组比较，模型组小鼠脑组织AchE/β-actin相对灰度值明显增高（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量活血荣络片组和多奈哌齐组小鼠脑组织AchE/β-actin相对灰度值降低（P＜0.01）；与多奈哌齐组比较，低剂量活血荣络片组小鼠脑组织AchE/βactin相对灰度值增加（P＜0.05），而中、高剂量活血荣络片组AchE/β-actin相对灰度值变化无统计学意义（P＞0.05）。

表1　各组小鼠脑组织AchE/β-actin相对灰度值的比较（±s）

表1　各组小鼠脑组织AchE/β-actin相对灰度值的比较（±s）

与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与多奈哌齐组比较，#P＜0.05。下同。

组别　n正常组　10模型组　10低剂量活血荣络片组　10AchE/β-actin相对灰度值0.122±0.1031.520±0.132**1.186±0.217**△△#中剂量活血荣络片组　10　0.416±0.161**△△高剂量活血荣络片组　10　0.332±0.121**△△多奈哌齐组　10　0.460±0.263**△△

图1　小鼠脑组织AchE蛋白表达情况

2.2各组小鼠脑组织中ChAT的含量比较见表2，图2。与正常组比较，模型组小鼠脑组织ChAT/β-actin相对灰度值明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量活血荣络片组和多奈哌齐组小鼠脑组织ChAT/β-actin相对灰度值增高（P＜0.01）；与多奈哌齐组比较，高剂量活血荣络片组小鼠脑组织ChAT/βactin相对灰度值增加（P＜0.05），而低、中剂量活血荣络片组ChAT/β-actin相对灰度值变化无统计学意义（P＞0.05）。

表2　各组小鼠脑组织ChAT/β-actin相对灰度值的比较（±s）

表2　各组小鼠脑组织ChAT/β-actin相对灰度值的比较（±s）

组别　n正常组　10模型组　10低剂量活血荣络片组　10ChAT/β-actin相对灰度值1.224±0.414 0.453±0.162**0.755±0.208**△△中剂量活血荣络片组　10　0.865±0.225**△△高剂量活血荣络片组　10　0.943±0.280**△△#多奈哌齐组　10　0.865±0.167**△△

图2　小鼠脑组织ChAT蛋白表达情况

3　讨　论

阿尔茨海默病的发病机制复杂，病因尚不明确，但目前大多学者支持胆碱能假说，认为Ach的缺失是致病的关键原因［4］。研究显示［5］脑内胆碱能神经元退变是造成AD最重要的病理因素之一，胆碱能系统与记忆的形成、存储有关，与学习记忆能力亦密切相关，胆碱能系统的损伤能引起学习、记忆的减退。Ach作为中枢神经系统重要的神经递质之一，与AD患者的痴呆严重程度紧密相关。大多数学者的研究表明［6］Ach活性在AD患者的大脑中明显降低，同时在AD早期也发现了胆碱能缺少的临床表现，并且增加脑内Ach水平能够有效改善记忆功能。

研究显示［7］，机体通过多方面的调节方式对学习、记忆进行调控，中枢胆碱能系统作为重要的通路发挥重要作用，与学习、记忆密切相关，该通路的核心便是Ach这一重要的神经递质。Ache对中枢神经系统的调节是双向的，既有兴奋作用也有抑制作用，但以兴奋作用为主，参与皮层唤醒、情绪和运动的协调等生理过程，特别是学习记忆方面被认为是关键环节。Ach在脑内分布广泛，其合成与代谢分解与ChAT和AchE密切相关，两者共同作用维持Ach含量的动态平衡，同时两者的活性也反映了Ach的合成和代谢速率。患者脑内AchE和ChAT活性变化被认为是AD的重要生化特征。多项研究表明［8-9］，Ach分解加速，严重影响学习记忆和认知能力；同时发现老年性痴呆患者Ach合成明显减少，ChAT的活性下降，与痴呆的严重程度相关。所以选取AchE和ChAT作为研究对象，间接评价Ach含量变化。

活血荣络片为周德生教授经验方。痴呆病位在脑络，发病与肾虚、气虚、气滞、肝郁、痰浊相关，但不论那种皆可“致瘀”，故“祛瘀通络”是治疗关键。活血荣络片含石菖蒲、鸡血藤、玄参、黄精、生地黄、乳香、川芎、没药等，重在祛瘀通络。方中川芎、鸡血藤、乳香、没药、石菖蒲活血行气，化痰解毒，使脑髓纯净，脑络通畅；辅以黄精、玄参、生地黄健脾益肾，滋养阴气，化生脑髓，脑络得养。现代药理已证明上述药物多具有改善循环、促智的作用［10］。同时，相关研究还显示［11-12］活血类方剂能明显增高AD大鼠的AchE的含量，提高ChAT活性，降低脑内AchE活性，从而增加Ach含量，保护大脑学习记忆能力，对中枢胆碱能损害有一定的修复作用，从而达到改善学习记忆的目的。

本研究中，模型组大幅度提高小鼠脑组织AchE的表达量，降低了ChAT的表达。低、中、高剂量活血荣络片组、多奈哌齐组均能不同程度的降低脑组织中AchE的含量并提高ChAT的含量，从而一定程度上促进Ach蓄积，进而具有延缓痴呆病程的可能，且中、高剂量活血荣络片组降低AchE表达量的效果与多奈哌齐组相当，高剂量活血荣络片组提高ChAT的含量优于多奈哌齐组。近年来，多项研究亦显示［13-15］，通过一定的干预手段对AD模型动物胆碱能系统功能的调节，即提高脑组织中ChAT活性，抑制AchE活性，增加Ach的含量，可减轻大鼠学习记忆功能，改善痴呆症状，进而减轻对中枢神经系统的损害，对中枢神经系统有一定的保护作用。本次实验中，通过不同剂量活血荣络片灌胃处理，影响了AD模型小鼠体内AchE和ChAT蛋白的表达，进而起到提高Ach含量的作用，可能与活血荣络片影响机体内环境的变化有关。由于本研究仅从胆碱能递质途径的表达入手，为活血荣络片的临床应用提供一定的实验依据，仍需进一步研究。

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中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）03-0393-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.006

*基金项目：湖南省自然科学基金（14JJ6038）；湖南省科技厅课题（2014sk3037）

通信作者△（电子邮箱：hh201201201＠163.com）

收稿日期（2015-11-28）

Effect of Huoxue Rongluo Tablets on the Expression of ChAT and AchE in AD Model Mice

LI Shan，HU Hua，ZHOU Desheng.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Huoxue Rongluo Tablets on the expression of acetylcholinesterase（AchE）and acetylcholine transferase（ChAT）in brain tissue of mice with Alzheimer′s disease （AD）.Methods：50APP/PS1 transgenic AD model mice were randomly divided into five groups，with10rats in each.10KM mice with the same age were chosen as the normal group.The stomach was filled once a day，and continuous treatment lasted for 2months.After treatment，the brain tissues of mice were taken to detect the content of AchE and ChAT with Blot Western.Results：Compared with the normal group，the expression of AchE protein in brain tissue of mice in AD model group increased，and the expression of ChAT protein decreased（P＜0.01）.Compared with the model group，AchE protein expression in brain tissue of low，middle and high dose of Huoxue Rongluo Tablets group and donepezil group decreased and the expression of choline acetyltransferase protein increased（P＜0.01）.Compared with Donepezil group，the reduce of AchE protein expression in middle and high dose of Huoxue Rong luo decoction group had no statistical significance（P＞0.05），and high dose of Huoxue Rongluo Tablets group improved ChAT protein expression（P＜0.05）.Conclusion：The expression of AchE protein in brain tissue of AD model mice can be inhibited to a certain extent and ChAT protein can be promoted with Huoxue Rongluo Tablets.

【Key words】Huoxue Rongluo Tablets；Alzheimer disease；Acetylcholinesterase；Acetylcholine transferase