两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究*

汤小康　李　敏　应　航　卢　敏（.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙40007；.浙江中医药大学医学技术学院，浙江杭州30053）



两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究*

汤小康1△李敏2应航2卢敏1
（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.浙江中医药大学医学技术学院，浙江杭州310053）

【摘要】目的比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异。方法提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织，将其剪碎并随机分成2等份，标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组；用0.25%的胰蛋白酶预消化后，分别用0.02%Ⅰ型胶原酶和0.02%Ⅱ型胶原酶在37℃消化3次，每次1 h；将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心，获取细胞并进行培养与传代；对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理，比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异。结果1）细胞计数：Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/mL、5.50×104个/mL、6.25×104个/mL，获得软骨终板数目（5.83±0.31）×104个/mL；Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/mL、9.50×104个/mL、8.25×104个/mL，获得软骨终板数目（8.83±0.51）×104个/mL，Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组；2）细胞形态：两组软骨终板细胞多呈多角形，胞核大而圆，形态无明显差异。3）细胞增殖：Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD值为（0.561±0.003），Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为（0.562±0.002），组间差异无统计学意义（P > 0.05）。结论Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养。

【关键词】软骨终板细胞Ⅰ型胶原酶Ⅱ型胶原酶细胞培养

椎间盘源性腰痛临床患病率较高，病情典型者严重影响患者日常生活，其属于中医学“腰痛”范畴，益气补肾是中医治疗腰痛的基本方略之一［1］。现代医学研究认为，椎间盘的退变与颈、腰椎疾病的发生密切相关［2］，软骨终板退变是导致椎间盘退变的始动因素［3］。随着对脊柱退行性疾病研究的深入，针对软骨终板细胞的研究也日益丰富。如何在实验室高效获得椎间盘软骨终板细胞，对研究中药干预“腰痛”的具体机制有着极为重要的意义。有研究指出Ⅱ型胶原是椎间盘细胞外基质表达的特征性产物［4］，因此有理由相信Ⅱ型胶原酶在原代椎间盘软骨终板细胞分离培养中具有独特优势。为验证Ⅱ型胶原酶在软骨终板细胞培养中的效率优势，本实验选取了实验室常用于细胞消化分离培养的Ⅰ型胶原酶作为参照，进行了相关研究。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物4周龄新西兰大白兔4只，雌雄各2只，体质量0.5～0.75 kg，清洁级，由浙江中医药大学动物实验中心提供。实验动物合格证号：XL202081、室温饲养。

1.2主要试剂、仪器和材料胰蛋白酶（Gbico）、Ⅰ型胶原酶（Sigma）、Ⅱ型胶原酶（Sigma）、PBS缓释液（吉诺生物医药技术有限公司）、DMEM培养液（吉诺）、胎牛血清（四季青）、洁净工作台（Airtech）、普通手术器械、眼科手术器械、电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）、台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、天枰、计数板及计数器、6孔培养板（NEST）、96孔培养板（NEST）、培养箱（Thermo）、倒置相差显微镜（Olympus）、BioTek 800酶标仪（美国BioTek公司）等。

1.3椎间盘软骨终板细胞体外的分离与培养

1.3.1椎间盘软骨终板的取材及预消化兔耳缘静脉水合氯醛过量给药处死新西兰大白兔，背部备皮，75%酒精消毒后铺巾，沿后正中线切开皮肤，分离椎旁肌肉，取下颈胸腰段脊柱；在超净台中剔除脊柱周围肌肉组织及筋膜，用0.01 mol/L PBS冲洗至无明显血迹，分离椎间盘软骨终板组织，置于PBS溶液中，待所有软骨终板取好后用培养液洗两遍，分别用眼科剪剪成1 mm×1 mm的小块，用天枰将其分为两等份，并分别转移入50mL无菌离心管中，加入15 mL 0.25%胰蛋白酶进行预消化，37℃水浴中放置30min，1000r/min离心5 min，保留组织块及沉淀，去上清液。

1.3.2Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的干预将两组椎间盘软骨终板组织随机标记为Ⅰ型胶原组与Ⅱ胶原型组，分别以5 mL 0.02%Ⅰ型胶原酶和0.02%Ⅱ型胶原酶37℃水浴中消化1 h，将含细胞的消化液以1000r/min离心8 min，弃上清液，沉淀的细胞团块用DMEM培养液（含10%胎牛血清）吹打混匀。剩余骨片再加入5 mL新的同类胶原酶继续消化1 h，重复以上步骤3次。

1.4细胞接种与传代将3次消化所得的两组软骨终板细胞各自充分混匀并进行3次计数，计数结束后将其接种于2块6孔培养板中，置于37℃5%CO2培养箱中培养。48 h后倒置相差显微镜下观察细胞形态，并换液1次，此后每隔36h换液1次。显微镜下观察细胞长至皿底的60%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，计数后将两组软骨终板细胞稀释至5.0×105个/mL，均匀接种于6孔和96孔培养板中传代培养。

1.5指标观察1）细胞计数：原代软骨终板细胞混悬液接种前，分别从两组充分混匀的细胞混悬液中吸取适量细胞悬液，置于清洁计数板上计数，分别计数3次。细胞数（个/mL）=4个大格细胞数/4×10000。2）细胞形态：原代软骨终板细胞培养48 h后，将两组盛有软骨终板细胞的6孔培养板置于倒置相差显微镜下进行观察、拍照。第2代软骨终板细胞培养48 h后，将两组盛有软骨终板细胞的6孔培养板置于倒置相差显微镜下进行细胞形态观察并拍照。3）细胞增殖：第2代软骨终板细胞培养48 h后，从盛有两组盛有软骨终板细胞的96孔培养板中各选6个培养孔，分别加入10mL MTT溶液，37℃继续孵育4 h后吸弃培养液，再加入100μL MTT溶解剂，于570nm波长处测定两组软骨终板细胞的光密度（OD）。

1.6统计学处理采用SPSS18.0统计软件分析。两组软骨终板细胞OD值组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1两组软骨终板细胞计数结果比较见表1。3次细胞计数结果显示，Ⅱ型胶原组软骨终板细胞数明显多于Ⅰ型胶原组。

表1　两组软骨终板细胞计数结果比较（个/mL）

2.2两组细胞形态比较见图1。图A中Ⅰ型胶原组原代软骨终板细胞培养48 h可见部分细胞贴壁，大部分细胞悬浮，贴壁细胞为多角形，胞核大而圆，有2～3个核仁（400倍）；图B中Ⅱ型胶原组原代软骨终板细胞培养48 h部分细胞贴壁，可见悬浮细胞，贴壁细胞呈现多角形，胞核大而圆，有2～3个核仁（400倍）。图C中Ⅰ型胶原组第2代软骨终板细胞培养48 h大部分细胞贴壁，少许细胞悬浮，贴壁细胞为多角形（200倍）；图D中Ⅱ型胶原组第2代软骨终板细胞培养48 h大部分细胞贴壁，少许细胞悬浮，贴壁细胞呈多角形（200倍）。两组原代软骨终板细胞培养48 h，显微镜下观察见部分细胞贴壁，外观呈多角形，胞核大而圆，有2～3个核仁，胞浆丰富，含少许分泌颗粒，两组软骨终板细胞形态无明显差异；两组第2代软骨终板细胞培养48 h，显微镜下观察见大部分细胞贴壁，外观呈多角形，胞核大而圆，有2～3个核仁，胞浆丰富，含分泌颗粒，两组软骨终板细胞形态亦无明显差异。

2.3细胞增殖Ⅰ型胶原组第2代软骨终板细胞MTT读数OD值为（0.561±0.003）与Ⅱ型胶原组第2代软骨终板细胞OD值（0.562±0.002）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图1　两组原代、第2代软骨终板细胞比较

3　讨　论

椎间盘源性腰痛多为椎间盘退行性改变，进而刺激椎间盘软骨终板、髓核及纤维环等组织，引起椎间盘内痛觉感受器变化进而产生，用药宜从气血入手，兼之补肾，以此治疗各种椎间盘源性腰痛［5］。椎间盘可分为髓核、纤维环和软骨终板，每种组织均含有丰富的细胞外基质和不同形态的细胞，其自身无血管分布，营养主要通过渗透作用送达［6-7］。软骨终板是椎间盘主要的营养渗透介质，同时也是维持脊柱生物力学的重要组成部分，因此椎间盘的病变过程往往伴有软骨终板的异常变化。通过实验研究生长因子注射、转基因干预、细胞移植等方法促进基质再生从而修复受损的椎间盘已成为脊柱基础研究领域的热点［8］，针对中药及相关成分干预软骨终板进而治疗椎间盘源性腰痛的研究也日益增多［9-10］。软骨终板作为椎间盘组织中的重要组成部分，建立稳定的软骨终板细胞培养体系，有助于系统的研究各种手段干预脊柱疾病的机理。本研究在实验中成功的应用胰蛋白酶与Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶联合消化分离培养软骨终板细胞，并发现原代软骨终板细胞在培养48 h后仍未完全贴壁，因此软骨终板细胞的实验室培养，其贴壁的时间较其他种类细胞时间长，实验过程中应尽量避免早期的移动培养容器，防止细胞不贴壁，这将为今后同类的研究工作提供借鉴。

软骨终板的生物化学成分主要包括蛋白多糖、胶原和水。蛋白多糖是维持椎间盘正常结构、代谢和生物力学性能的生化基础；胶原纤维平行于椎体的上下面排列，纤维上附着蛋白多糖分子，纤维相互间的交叉构成有通透性的弹力网；水分是软骨终板的重要组成成分，其含量的变化与蛋白多糖的含量密切相关［11］。蛋白聚糖和Ⅱ型胶原同为椎间盘细胞外基质表达的特征性产物，目前认为上调蛋白聚糖、Ⅱ型胶原基因表达能有效减少软骨终板细胞凋亡，进而达到减轻椎间盘损伤的病理发展的目的［12］。在同一组织中，常同时存在几种类型的胶原，但常有一种类型占优势，而软骨周围基质中则主要为Ⅱ型胶原。胶原酶有多种同工酶，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型及肝细胞专用酶，Ⅰ、Ⅱ型胶原酶属同工酶，均可消化各型胶原，但软骨终板周围基质中主要为Ⅱ型胶原，因此Ⅱ型胶原酶在软骨终板细胞培养中具有潜在优势。本研究通过细胞计数和细胞增殖测定等实验方法，研究发现Ⅱ型胶原酶在相同条件下较Ⅰ型胶原酶能获得更多的软骨终板细胞，但两者在酶消化获得细胞的增殖活性上不存在显著差异，以此供研究者合理设计实验方案提供参考。

参考文献

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中图分类号：R274

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）03-0397-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.007

*基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2110928）

通信作者△（电子邮箱：tangxk＠yeah.net）

收稿日期（2015-11-13）

Comparison Study of Two Different Type of Collagenases′Digestion Efficiency on Cartilage Endplates Culture

TANG Xiaokang，LI Min，YING Hang，et al.
The First Affiliated Hospital of Hunan Chinese Medicine University，Hunan，changsha 410007，China.

【Abstract】Objective：To evaluate the different efficiency of cartilage endplates obtained by Type-Ⅰcollagenase digestion and Type-Ⅱcollagenase digestion.Methods：The New Zealand White Rabbits were used for cartilage endplates tissue obtained.The tissue fragments were equally divided into 2parts，and marked as group of Type-Ⅰcollagenase and group of Type-Ⅱcollagenase.Both of them were digested by trypsin for15 minutes.Then they were digested by typeⅠcollagenase and typeⅡcollagenase separately for three times，each time lasting about1hours.The cells suspension got from the three-time digestions mixed the cells were cultured.The cells in 2groups were respectively counted.Their shapes were observed and their proliferation were assayed.The differences between the two groups of cell counted，shapes and proliferation were compared.Results：The results of cell counting showed that the cell number of Type-Ⅰcollagenase group was smaller than Type-Ⅱcollagenase.Both of cells had polygon shapes.Type-Ⅰcollagenase group′s OD was（0.561±0.003），and Type-Ⅱcollagenase group′s OD was（0.562±0.002）.There was no statistical difference in optical density between them（P > 0.05）.Conclusion：The efficiency of cartilage endplates obtained in typeⅡgroup is higher Type-Ⅰcollagenase.

【Key words】Cartilage endplates；TypeⅠcollagenase；TypeⅡcollagenase；Cell culture