防己黄芪汤对阿霉素肾病大鼠肾组织乙酰肝素酶表达的影响*

符　强　黄亚仙　王闻婧（.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江哈尔滨50040；2.湖北中医药大学，湖北武汉43006）



防己黄芪汤对阿霉素肾病大鼠肾组织乙酰肝素酶表达的影响*

符强1黄亚仙1王闻婧2△
（1.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江哈尔滨150040；2.湖北中医药大学，湖北武汉430061）

【摘要】目的观察防己黄芪汤对阿霉素肾病大鼠肾小球滤过功能的作用，探讨该方减少蛋白尿，治疗肾小球疾病的可能机制。方法尾静脉注射阿霉素法建立阿霉素肾病大鼠模型，成模后，根据24 h尿蛋白定量随机分为模型组、防己黄芪汤高、低剂量治疗组，连续给药5周，分别测定各组大鼠24 h尿蛋白定量及肾组织乙酰肝素酶（HPA）表达。结果模型组大鼠24 h尿蛋白定量和肾组织HPA表达升高明显高于正常组（P＜0.05）；与模型组比较，防己黄芪汤高、低剂量治疗组24 h尿蛋白定量和肾组织HPA表达均明显改善（P＜0.05）。结论防己黄芪汤减少模型大鼠尿蛋白的作用可能与调节肾组织HPA表达，保护足细胞受损有关。【关键词】阿霉素肾病防己黄芪汤乙酰肝素酶

研究表明，防己黄芪汤在治疗慢性肾脏病方面可通过修复受损肾小球滤过屏障，恢复滤过功能，达到保护肾功能的作用。本实验旨在观察该方对阿霉素肾病大鼠24 h尿蛋白定量、肾组织乙酰肝素酶（HPA）表达的影响，为其临床应用提供一定的实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级Wistar雄性大鼠，48只，体质量100～150g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2药物与试剂防己黄芪汤组成及剂量：防己20g，黄芪25 g，白术7.5 g，炙甘草10g。上述饮片由黑龙江中医药大学国医堂提供，加水500mL，浸泡30min，煎煮30min，滤出药渣，再次加水400min煎煮45 min，将2次煎取液合并混匀，恒温60℃条件下浓缩至含生药量5.63 g/mL。4℃保存，使用前加温至37℃。阿霉素注射液（盐酸多柔比星）规格：10mg/支（Pfizer Italia S.r.l.，批号2QL0036），购于哈药集团医药有限公司。逆转录酶试剂盒：PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara，D6210A）。

1.3造模与分组实验大鼠适应性饲养1周，随机留取8只为正常组，其余40只大鼠制作阿霉素肾病模型：阿霉素注射液（盐酸多柔比星）按2.75 mL/kg（5.5 mg/kg）和1.5 mL/kg（3 mg/kg）的剂量进行2次尾静脉注射，2次间隔时间为2周。造模结束，根据每只成模大鼠24 h尿蛋白定量随机分组，各组分离饲养。实验共分4组：正常组、模型组、防己黄芪汤高剂量治疗组和防己黄芪汤低剂量治疗组。

1.4给药方法治疗组剂量折算方法：低剂量组按临床等效量折算（1 mL/100g），高剂量组为临床等效量2倍（2mL/100g），模型组和正常组予等量蒸馏水灌胃。给药时间均为连续5周。

1.5标本采集及检测大鼠分别置代谢笼24 h，收集全部尿液，测定尿蛋白量。每组随机选取3只大鼠，脱颈椎处死后，取左侧肾脏，液氮冻存。1）24 h尿蛋白定量［1］。采用磺柳酸-硫酸钠法。2）肾组织HPA mRNA表达。采用RT-PCR法。提取各组样本总RNA，采用核酸蛋白分析仪分别测定不同组样品所提RNA浓度，分别取相同量RNA为模板（本实验所取RNA量为1 μg），对目的基因HPA和内参基因β-actin行逆转录反应，取反应产物1.5 μL行PCR扩增。分别取相同体积的PCR扩增产物6μL进行电泳，电泳后用凝胶成像系统进行成像分析。HPA引物序列：上游5′-CAGCAGG ACACGTCATCATCA-3′，下游5′-TGCAGCCATCACAT GACCA-3′。β-actin引物序列：上游5′-CAACCGTGAAAAGATGACCCA-3′，下游5′-AATGCCAGTGGT ACGACCAGA-3′。

1.6统计学处理采用SPSS17.0统计软件分析。计量数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组24 h尿蛋白定量比较见表1。与正常组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白定量明显升高（P＜0.05），说明造模成功；与模型组比较，防己黄芪汤高、低剂量组大鼠尿24 h蛋白量则明显减少（P＜0.05）。

表1　各组大鼠24 h尿蛋白定量比较（mg，±s）

表1　各组大鼠24 h尿蛋白定量比较（mg，±s）

与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别　n 24 h尿蛋白定量正常组　3模型组　3防己黄芪汤低剂量组　3 23.77±1.63△76.73±39.87 27.31±18.48△防己黄芪汤高剂量组　347.35±22.63△

2.2肾组织HPA mRNA表达见图1，表2。与正常组比较，模型大鼠HPA mRNA表达明显增加（P＜0.05）。防己黄芪汤高、低剂量治疗组与模型组比较HPA mRNA表达下降（P＜0.05），两治疗组组间差异不明显。

3　讨　论

防己黄芪汤是治疗表虚水肿的代表方剂，临床用于治疗肾脏系统疾病较多。近年来已有该方减少蛋白尿的临床和实验研究报告，表明其在减少肾小球疾病患者蛋白尿，改善其临床症状，从而延缓其肾功能下降方面有良好作用，所以有必要进一步探讨其作用机制［2-4］。

M，100bp marker（从下到上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp），1.正常组；2.防己黄芪汤低剂量组；3.防己黄芪汤高剂量组；4.模型组

表2　各组大鼠肾组织HPA mRNA表达（±s）

表2　各组大鼠肾组织HPA mRNA表达（±s）

组别　n　表达相对系数β-actin基因光密度　HPAmRNA光密度正常组　3　0.7996±0.063模型组　3　1.2816±0.171防己黄芪汤低剂量组　3　1.0968±0.054 2680560　2109560△3644208　4490304 2874444　3113806△防己黄芪汤高剂量组　3　0.8507±0.025 2408625　2117360△

蛋白尿是各种肾脏疾病共有的临床表现，尿中蛋白质的量和持续时间直接反映肾小球滤过功能和肾小管重吸收功能的好坏，所以蛋白尿成为评价治疗肾脏疾病药物疗效的重要指标，能有效降低24 h尿蛋白定量是大多数肾脏病治疗的首要任务。本研究组已有研究结果表明，防己黄芪汤可以通过减少阿霉素肾病大鼠肾组织Podocin及Nephrin表达，保护模型大鼠肾小球滤过功能［5-6］。从本次实验结果看，阿霉素造模后，大鼠尿蛋白量明显增加，说明其肾小球滤过功能被严重破坏。治疗组大鼠尿蛋白排出量减少，但组间比较并无明显差异，未见明显量效关系。

3.2防己黄芪汤对阿霉素肾病大鼠肾组织HPA基因表达的影响肾小球滤过屏障（GFB）包括电荷屏障和机械屏障，其各组分的损伤及其相互作用障碍，均参与蛋白尿的形成［7］。其中肾小球基底膜（GBM）主要承担电荷屏障作用。GBM上有多种蛋白与肾小球滤过功能相关，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）是其中之一，由此蛋白为主要成分所构成的阴离子位点使肾小球滤过膜具备电荷屏障［8-10］。HSPG相连形成带有多量负电荷的硫酸肝素（HS）多糖链，这决定了GBM的电荷选择通透性［11-12］。因此，各种病因破坏滤过膜上的HS，破坏肾小球上皮细胞与内皮细胞的锚连位点，会使滤过膜电荷选择性降低，导致滤过屏障功能异常［13］。HPA是一种可特异性水解HS，降解HSPG上HS多糖链的内切葡糖醛酸酶，HS水解后，肾小球的电荷屏障被破坏，导致蛋白尿的出现和增加［12-13］。相反，GBM上的HPA表达减少，滤过膜电荷选择性得到保护，蛋白尿可相应减少［14］。从本次实验结果看，HPA在正常大鼠肾组织上仅有微量表达。模型大鼠表达则明显增加。防己黄芪汤治疗组大鼠肾组织HPA基因水平降低，表明该方可通过降低肾组织HPA基因表达对阿毒素肾病大鼠肾小球滤过膜的电荷屏障产生保护作用。

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中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）03-0387-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.004

*基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12541750）

通信作者△（电子邮箱：yangjian13r＠163.com）

收稿日期（2015-11-13）

Effects of Fangji Huangqi Decoction on the Expression of Heparanase Adriamycin Nephropathy

FU Qiang，HUANG Yaxian，WANG Wenjing.
Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin150040，China.

【Abs tract】Objective：To study the protection of Fangji Huangqi Decoction on the Adriamycin Induced Nephropathy（AIN）rats and explore its mechanism.Methods：Wistar rats were given intravenous injections of ADR via tail vein，establishing adriamycin-induced nephropathy rat model.The model rats were randomly divided into the model group and the treatment groups of high-dosage and low-dosage medicine，and were then administered intragastrically by medicine in corresponding dosage.In next 5 weeks，rats in each group were detected in 24 hours urinary protein.Renal tissues routine was fixed，and heparanases expression was detected with reverse transcription PCR.Result：Those indices in the modle group were higher obviously than those in the routine group including the 24 hours urinary protein and the renal tissue HPA.However，these indicators of the highdosage and low-dosage medicine group were improved signifcantly than the modle group（P＜0.05）.Conclusion：Fangji Huangqi Decoction can reduce the quantity of 24 hours urine protein of Adriamycin Induced Nephropathy rats，and protect the glomerular filtration barrier by moderating the expression of heparanases.

【Key words】Adriamycin nephropathy；Fangji Huangqi Decoction；Heparanase