安化黑茶对高脂血症大鼠主动脉核因子-κB的影响*

汤　艳　易　健　彭千元　吴琨鹏　周胜强　刘柏炎（湖南中医药大学，湖南长沙410000）



安化黑茶对高脂血症大鼠主动脉核因子-κB的影响*

汤艳易健彭千元吴琨鹏周胜强刘柏炎△
（湖南中医药大学，湖南长沙410000）

【摘要】目的观察安化黑茶对高脂血症大鼠主动脉核因子-κB（NF-κB）的影响。方法60只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组10只和造模组50只，对照组给予普通饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养，连续喂养12周，同时，维生素D3腹腔注射。12周后断尾采血，检测大鼠血脂，验证模型是否成功。将造模成功的造模组大鼠先分层后随机分组，每组10只，对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃；黑茶低、中、高剂量组及阿托伐他汀组分别按其对应浓度灌胃4周，并继续高脂饲料喂养。实验结束后采用免疫组化法与RT-PCR的方法检测胸主动脉NF-κB表达水平。结果本实验可以成功制备高脂血症模型。安化黑茶干预后NF-κB表达水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05），但组间差异未达到统计学意义（P＞0.05）。结论安化黑茶能抑制高脂血症大鼠主动脉NF-κB蛋白和基因的表达。

【关键词】黑茶高脂血症核转录因子-κB炎症

动脉粥样硬化（AS）作为心脑血管疾病的病理基础［1］，其发病机制尚未完全明确，但脂质代谢紊乱学说和慢性炎症学说已得到普遍公认。炎症反应在AS的发生和发展中起着重要作用，这方面研究颇多，然而高脂血症与炎症反应这方面研究却有限。近代研究发现安化黑茶具有降脂作用，其是否具有抗炎作用却不明确，本实验拟从高脂血症与核转录因子-κB（NF-κB）的关系入手，研究和探讨安化黑茶对高脂血症大鼠NF-κB的影响，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物6.0只雄性SD大鼠，SPF级，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。实验环境：湖南中医药大学动物实验室，温度20～22℃，相对湿度50%～60%。

1.2药物与试剂黑茶购自于白沙溪茶厂天茯茶（1000g）。阿托伐他汀钙胶囊（尤佳，国药准字：H20070054）。维生素D3注射液（哈尔滨宏达动物药品厂，生产批号20140303），NF-κB P50、P65抗大鼠单克隆抗体（abcam公司），SABC试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉试剂公司），水合氯醛、多聚甲醛、柠檬酸盐（北京鼎国生物公司），Trizol（ambion），逆转录试剂盒（Thermo）；qPCR试剂盒（TaKaRa），引物（上海生工）。高脂饲料：按文献［2］加以改进配制高脂饲料（3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%猪油、5%白糖、86.3%标准饲料）。

1.3实验仪器半自动生化分析仪（美国Rayto生产）；高速冷冻离心机（德国）；电脑程控组织脱水机（襄樊徕克生物电子仪器厂）；自动双重纯水蒸馏器（上海玻璃仪器一厂）；101-2型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；BX43奥林巴斯荧光显微镜及IPP6.0图像分析系统（日本Olympus公司）；荧光定量PCR仪（eppendorf）；核酸蛋白浓度测定仪、核酸水平电泳仪（Bio Drop）；梯度PCR扩增仪（Bio-RAD）等。

1.4模型制备大鼠普通饲料适应性喂养1周后，先按体质量分层后随机分为正常组（10只）和造模组（50只），对照组给予普通饲料喂养，造模组给予自制高脂饲料喂养，自然摄食，连续喂养12周。同时，造模组在造模前一次性腹腔注射维生素D360万IU/kg，造模后3、6、9周各补充维生素D310万IU/kg腹腔注射［2］，正常组同时给予等体积的生理盐水腹腔注射。12周后禁食不禁水12h断尾采血，2000r/min，4℃离心10min，分离血清。半自动生化仪检测两组血清血脂水平，造模组血脂各指标显著升高具有统计学意义者，确定模型建立成功。造模后，与正常组比较，造模组大鼠血清TC、TG、LDL-C升高达到显著水平（P＜0.01），HDL-C下降达到显著水平（P＜0.01），验证模型成功。

表1　造模后血脂水平比较（mmol/L，±s）

表1　造模后血脂水平比较（mmol/L，±s）

与正常组比较，*P＜0.01。

组别　LDL-C　HDL-C正常组　1.05±0.28　1.35±0.15模型组　27.03±2.26*0.97±0.15*n1050TC　TG 2.74±0.431.03±0.2034.50±3.33*2.48±0.54*

1.5给药方法黑茶推荐量为成人（按体质量60kg计）干茶10g/d［3］，将黑茶原料处理成碎状，按每克茶叶加12mL沸水进行煎煮，武火煎至沸腾后改文火，继续煎煮20min，取汁另置。继续加水，量较第1次稍少，煎煮沸腾后，文火续煎20min，取汁，两次茶水合并后按以下浓度浓缩。离心机去除残渣，4℃保存。造模成功后，按血脂水平分层后随机分为5组，每组10只。黑茶高剂量组为2.03 mg/kg、黑茶中剂量组为1.015 mg/kg、黑茶低剂量组为0.5075 mg/kg、阿托伐他汀组为10mg/kg［4］，正常组和模型组给予用药组等体积蒸馏水灌胃；灌胃量为5 mL/（kg·d），每天上午10∶00一次性给药，连续灌胃4周。以上剂量均采用成人体质量60kg体表面积换算法。

1.6标本采集与检测

1.6.1胸主动脉NF-κB蛋白表达变化检测实验结束，禁食不禁水12h，大鼠以10%水合氯醛（4.0mL/kg）腹腔注射麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血约5 mL备用，后自主动脉弓根部向下剪至腹主动脉分叉处，剥离结缔组织，生理盐水冲洗干净，将组织放在4%多聚甲醛中备用。每组选取4只大鼠胸主动脉，石蜡包埋，切片，烤片，常规脱蜡；柠檬酸盐液高温高压修复2min，3%H2O2孵育10min；PBS冲洗3 min×3次；滴加正常山羊血清孵育15 min，后倾去；滴加一抗（NF-κB P50、P65稀释比例均为1∶200），4℃过夜；PBS冲洗3 min×3次；滴加二抗室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素室温15 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加DAB显色剂，自来水充分冲洗，脱水，中性树胶封片。应用Olympus BX-51光学显微镜，400倍镜下随机选取10个不重复的视野，由图像分析系统计数平均光密度。

1.6.2胸主动脉NF-κB mRNA表达变化检测使用Trizol提取RNA，采用两步法逆转录合成cDNA，qPCR扩增。根据各基因序列设计引物：β-actin 5′-ACAA CCTTCTTGCAGCTCCTC-3′，5′-CTGACCCATACCCAC CATCAC-3′；NF-κB P505′-GGACAACTATGAGATGA GCTCCG -3′，5′-GCTGAGTTTGCGGAAGGATG -3′；NF-κB P655′-CATACGCTGACCCTAGCCTG-3′，5′-TC ACTGAGCTC CCGATCAGA-3′。每个样本做3个平行反应后取平均值。

1.7统计学处理采用SPSS21.0统计软件分析。计量资料测定以（±s）表示，指标测定值先进行正态性检验后选择检验方法，多组间均数比较方差齐者用单因素方差分析，组间两组比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnet’s T3法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1黑茶对实验大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65蛋白表达的影响见图1，图2，表2。NF-κB P50、P65阳性表达主要表现为细胞胞质中棕色颗粒状阳性反应物。实验发现，与正常组比较，模型组大鼠主动脉NF-κB P50、P65阳性反应物棕色颗粒显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明长期高脂血症可以促进NF-κB的释放和表达，模型有意义。干预后各治疗组大鼠主动脉NF-κB P50、P65棕色颗粒状阳性反应物明显减少，与模型组比较，黑茶高、中、低剂量组大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65阳性细胞光密度值水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　各组大鼠胸主动脉炎症因子κB P50水平表达（免疫组化，400倍）

图2　各组大鼠胸主动脉炎症因子κB P65水平表达（免疫组化，400倍）

表2　各组大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65蛋白水平比较（OD，±s）

表2　各组大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65蛋白水平比较（OD，±s）

与正常组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与阿托伐他汀组比较，△P＜0.05。下同。

组别　n　NF-κB P50　NF-κB P65正常组　10　0.68±0.08*　0.68±0.05*模型组　10　2.03±0.09▲　1.89±0.19▲阿托伐他汀组　10　1.15±0.25*▲　0.76±0.08*黑茶高剂量组　10　1.62±0.33*▲　1.05±0.33*△黑茶中剂量组　10　1.30±0.21*▲　0.79±0.16*黑茶低剂量组　10　1.37±0.16*▲　0.99±0.26*▲

2.2黑茶对实验大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65基因表达的影响见表3，图3。与正常组比较，模型组大鼠主动脉NF-κB P50、P65 mRNA相对表达量比较显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），再次说明长期高脂血症可以促进NF-κB的释放和表达，模型有意义。经治疗后与模型组比较，黑茶高、中、低剂量组大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65 mRNA相对表达量显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与采用免疫组化法检测NF-κB蛋白表达结果大致相同。

3　讨　论

脂质代谢紊乱学说和慢性炎症学说都是AS主要发病学说，而在AS的炎症反应学说中，其化学反应学说［5］对两者关系进行了详细描述，脂质可以导致炎症反应。研究证实，长期高脂血症作用下，可损伤血管内皮细胞，LDL-C可以通过受损内皮进入血管内膜，并氧化修饰成低密度脂蛋白胆固醇（ox-LDL-C），ox-LDL能进一步导致血管内皮损伤、失衡，促进内皮细胞内氧化脂质的积累，活化氧化应激反应以及前炎症因子释放，如TNF-α、IL-10、CRP等，这些炎症因子能够加快NF-κB的激活与释放［6-8］，而NF-κB又能进一步加重炎症因子的释放，加速内皮损伤和脂质沉积。研究也表明，NF-κB能调控多种炎症因子，参与炎症过程中的多种信号传导途径［5］，如MAPK依赖性信号通路：致炎物质的配体首先激活相应受体，通过激活MAPK分子，导致NF-κB活化，从而调节炎性细胞因子的表达；TLR依赖性信号通路、ROS依赖性信号通路，同样可以使致炎物激活相应受体，使TLR或ROS活化NF-κB，促进炎性细胞因子的合成和释放。综上所述，高脂血症能促使炎症反应的发生与发展，而NF-κB参与炎症反应多信号传导途径，在AS发生发展中起到了关键作用。

表3　各组大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65 mRNA相对表达量比较（2-△△CT，±s）

表3　各组大鼠胸主动脉NF-κB P50、P65 mRNA相对表达量比较（2-△△CT，±s）

组别　n　NF-κB P50　NF-κB P65正常组6.　0.07±0.08　0.02±0.02模型组6.　9.24±6.39▲　1.01±0.16▲阿托伐他汀组6.　1.13±0.72*　0.30±0.14*黑茶高剂量组6.　2.17±0.84*　0.45±0.28*黑茶中剂量组6.　1.45±0.40*　0.25±0.07*黑茶低剂量组6.　1.58±0.38*　0.46±0.28*

图3　各组大鼠胸主动脉NF-κB p50、p65 mRNA相对表达量

随着黑茶产业的兴起，尤其是安化黑茶中“金花”冠突散囊菌的发现，其药用价值开始受到大众的关注。近年来茶叶界对其成分及其疗效研究颇多，研究表明，安化黑茶作为一类后发酵茶可以通过多途径产生降脂效用，如傅冬和、宋鲁彬等［9-10］研究表明其可通过激活PPARγ、PPARδ等途径产生降脂效用；杜万红等［11］研究发现黑茶能降低高脂血症大鼠血清血脂水平，保护血管内皮，其机制可能与抑制脂质过氧化、调节ADMA/NO系统有关。然而安化黑茶能否产生抑制炎症反应和其他效用并不明确。本实验研究发现：通过高脂饮食+腹腔注射维生素D3的方法可以成功制备高脂血症模型，且模型组NF-κB蛋白和基因表达均显著上升，说明高脂血症联合维生素D3可以促进NF-κB活化与释放，促进炎症的产生。实验同时发现，黑茶组能抑制高脂血症大鼠主动脉NF-κB蛋白和基因的表达，蛋白与基因的表达相对一致。实验提示安化黑茶降脂、抑制炎症反应，可能与调控NF-κB的表达有关。

参考文献

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［2］周红，吴晓燕，袁艺标，等.三种剂量维生素D3结合高脂饲料建立大鼠动脉粥样硬化模型的比较［J］.中国动脉硬化杂志，2012，20（11）：995-998.

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［5］刘俊田.动脉粥样硬化发病的炎症机制的研究进展［J］.西安交通大学学报：医学版，2015，36（2）：141-152.

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［9］宋鲁彬，黄建安，黄浩，等.中国黑茶对PPARs的作用研究［J］.茶叶科学，2008，（5）：319-325.

［10］傅冬和，刘仲华，黄建安，等.高通量筛选研究茯砖茶对FXR模型的作用［J］.食品科学，2007，28（5）：331-334.

［11］杜万红，刘仲华，施玲，等.花卷茶提取物对高胆固醇血症大鼠血脂和内皮功能的影响［J］.中南药学，2008，6（2）：129-132.

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）03-0390-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.005

*基金项目：湖南省财政厅资助项目（湘财教指［2013］240号）

通信作者△（电子邮箱：liubaiyan＠126.com）

收稿日期（2015-11-29）

In fluence of Dark Tea on Aortal NF -κB of Rats with Hyperlipidemia

TANG Yan，YI Jian，PENG Qianyuan，et al.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410000，China.

【Abstract】Objective：To observe the influence of dark tea on aortal NF-κB of hyperlipidemia rat.Methods：60male SD rats were randomly divided into the control group（n =10）and the model group（n = 50）.The control group were fed with normal diet，and the model group were fed with high fat diet for12weeks.Intraperitoneal injection of VitD3was used in the preparation of hyperlipidemia rat model.After12weeks，the tail blood of rats were used to detect blood lipid，so as to test if the model was successful.After the model was successfully established，the rats in the model group were randomly divided，10in each group.The control group and the model group were given equal volume of distiued water.Low，medium and high dose of dark tea group and Astorvastatin，respectively according to their corresponding concentration，received lavage for 4 weeks，and continued high fat feed.Immunohistochemical and RT-PCR methods were used to test aortal NF-κB expression level.Results：This experiment could successfully prepare hyperlipidemia model.Dark tea decreased NF-κB expression level after intervention，and the difference was statistically significant（P＜0.05），but the difference between groups did not reach statistical significance（P＞0.05）.Conclusion：Dark tea can inhibite the expression of hyperlipidemia rat aortal NF-κB protein and gene.

【Key words】Dark tea；Hyperlipidemia；Nuclear transcription factor κB；Inflammation