MDA⁃7／IL⁃24基因联合阿霉素对肝癌模型裸鼠金属基质蛋白酶及血管内皮生长因子的影响

钱鹤平，林家晓

1.海门市人民医院ICU，江苏海门226100；2.东南大学附属中大医院胃肝病科

MDA⁃7／IL⁃24基因联合阿霉素对肝癌模型裸鼠金属基质蛋白酶及血管内皮生长因子的影响

钱鹤平，林家晓

1.海门市人民医院ICU，江苏海门226100；2.东南大学附属中大医院胃肝病科

目的 探讨MDA⁃7／IL⁃24基因联合阿霉素对肝癌模型裸鼠金属基质蛋白酶及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影响。方法 建立肝癌移植瘤模型裸鼠后分为模型组（A组）、阿霉素组（B组）、MDA⁃7／IL⁃24组（C组）、联合干预组（D组），并给予不同条件干预。干预后2周、6周时，测定肿瘤体积和重量、基质金属蛋白酶（MMP）、VEGF表达量。结果 干预2周、6周时，B、C、D组小鼠肿瘤体积和重量均明显低于A组（P＜0.05），D组小鼠肿瘤的体积和重量显著低于B组和C组（P＜0.05），B、C、D组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP mRNA含量明显低于A组（P＜0.05），D组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA含量显著低于B组和C组（P＜0.05），B、C、D组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA含量明显低于A组（P＜0.05），D组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA含量显著低于B组和C组（P＜0.05）。结论 MDA⁃7／IL⁃24基因联合阿霉素能够有效地抑制肝癌模型裸鼠的肿瘤生长，减少MMP和VEGF的表达量。

肝癌；黑色素瘤分化相关抗原7；白细胞介素⁃24；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子

肝癌是消化系统恶性程度较高的一类恶性肿瘤，肿瘤组织血供丰富、癌细胞增殖活力极强，患者的生存率较低且转移率、复发率较高，整体预后较差［1］。阿霉素是肝癌常用的化疗药物，对癌细胞具有一定杀伤效应，但不能彻底杀死癌细胞，治疗后复发率较高。黑素瘤分化相关基因⁃7（melanomadifferentiation associated gene⁃7，MDA⁃7）是从黑素瘤细胞中提取具有抑癌作用的基因，根据生物学特性与染色体定位命名IL⁃24。研究［2］表明，MDA⁃7／IL⁃24基因具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且对正常细胞无任何效应。本文通过动物实验，探讨MDA⁃7／IL⁃24基因联合阿霉素对肝癌模型裸鼠金属基质蛋白酶及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物为BALB／c小鼠64只，购于东南大学实验动物中心（许可证号20151015），4～6周龄，雄性，体质量20～24 g，平均（22.02±1.12）g，本次研究报请东南大学附属中大医院临床研究伦理委员会批准；重组腺病毒MDA⁃7／IL⁃24由吉凯公司合成；阿霉素注射液：山西普德药业股份有限公司，批准文号：国药准字H14023143，规格10 mg；肝癌细胞中HepG2购于中国科学院上海细胞库；细胞培养用培养基、新生小牛血清、胰蛋白酶均购于Gibco公司；酶联免疫吸附试剂盒购于上海西唐生物公司，RNA抽提及检测试剂盒购于北京康为世纪公司。

1.2 肝癌移植瘤模型建立方法 取HepG2细胞株，培养在含有10%新生小牛血清的培养基中，每2天换液1次，待细胞贴壁长满后用胰酶消化传代，传代后取胰酶消化后的细胞，用PBS重悬并调节密度至2×106／ml，将0.2 ml细胞悬液注射于小鼠背部皮下。待肿瘤生长，挑选瘤体直径4～5 mm的移植瘤模型鼠用于药物干预。

1.3 动物分组及药物干预 移植瘤模型建立成功后，将模型鼠分为模型组（A组）、阿霉素组（B组）、MDA⁃ 7／IL⁃24组（C组）、联合干预组（D组）。A组小鼠给予相同剂量的生理盐水瘤内注射；B组小鼠给予1.00 mg／kg的阿霉素腹腔注射；C组小鼠给予重组腺病毒MDA⁃7／IL⁃24瘤内单点注射，剂量为2×106PFU／μl；D组小鼠给予1.00 mg／kg的阿霉素及2×106PFU／μl的重组腺病毒MDA⁃7／IL⁃24瘤内单点注射。

1.4 肿瘤组织的重量和体积 干预后2周、6周时，每组小鼠各取8只，颈椎脱臼法处死，解剖得到肿瘤组织后用电子天平称瘤体重量，后用游标卡尺测量小鼠移植瘤的长径a和短径b，按照下列公式计算肿瘤体积：V＝0.5×a×b2。

1.5 MMP和VEGF的表达量 干预后2周、6周时，肿瘤组织用于重量和体积测量后，用生理盐水清洗3～5遍，采用RNA抽提试剂盒提取组织中的RNA，采用反转录试剂盒合成RNA对应的cDNA第一链，而后用PCR扩增试剂盒扩增目的基因MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR2及内参基因β⁃actin。根据扩增曲线后计算MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR2 mRNA含量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料用x ±s表示，多组间计量资料的分析采用方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤体积和重量 干预后6周时，各组小鼠的肿瘤体积和重量均明显高于干预后2周时（P＜0.05）；干预2周时、6周时，B、C、D组小鼠肿瘤体积和重量均明显低于A组（P＜0.05），D组小鼠肿瘤的体积和重量显著低于B组和C组（P＜0.05），B组和C组小鼠肿瘤的体积和重量比较差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

表1 四组小鼠的肿瘤体积和重量比较（x ±s）Tab 1 Comparison of tumor volume and weight in 4 groups of mice（x ±s）

2.2 肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA的表达量干预后2周、6周时，A组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与干预后2周比较，6周时B、C、D组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA含量均明显降低（P＜0.05）；B、C、 D组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA含量明显低于A组（P＜0.05），D组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA含量显著低于B组和C组（P＜0.05），B组和C组小鼠肿瘤肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA含量无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

表2 四组小鼠中肿瘤组织中MMP3、MMP9 mRNA表达量的比较（x ±s）Tab 2 Comparison of expressions of MMP3 and MMP9 mRNA in tumor tissues of 4 groups of mice（x ±s）

2.3 肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA的表达量 干预后2周、6周时，A组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2的mRNA含量比较无统计学意义（P＞0.05），与干预后2周比较6周时B、C、D组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA含量明显降低（P＜0.05），B、C、D组小鼠肿瘤肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA含量明显低于A组（P＜0.05），D组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA含量显著低于B组和C组（P＜0.05），B组和C组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

表3 四组小鼠肿瘤组织中VEGF⁃C、VEGFR2 mRNA表达量的比较（x ±s）Tab 3 Comparison of expressions of VEGF⁃C and VEGFR2 mRNA in tumor tissues of 4 groups of mice（x ±s）

3 讨论

肝癌目前仍缺乏有效的靶向治疗药物，患者的临床预后较差。阿霉素是临床上常用的化疗药物，被用于多种恶性肿瘤的治疗，对增殖期的癌细胞具有杀伤作用，对肿瘤的发展具有抑制和缓解作用［3］。但是单独应用阿霉素治疗肝癌并不能彻底清除癌细胞，需要联合使用不同的药物以更有效地抑制肝癌病情发展［4］。MDA⁃7基因是近年来新发现的一类抑癌基因，所表达的产物IL⁃24属于IL⁃10家族［5］。已有多项研究证实，IL⁃24对多种癌细胞的增殖、侵袭、转移均具有抑制作用，同时也能诱导癌细胞的凋亡［6⁃7］。国内张翔等［8］研究显示，腺病毒过表达MDA⁃7能够抑制肝癌细胞的增殖。

相关研究表明，MDA⁃7／IL⁃24基因在黑色素瘤细胞中呈明显低表达，将其转入恶性黑色素瘤细胞中，具有阻滞生长、促进凋亡、促进分化的作用，而与细胞中P53、P16、P21、RB、Ras、Bax等状态无关，说明MDA⁃7／IL⁃24基因具备恶性肿瘤选择性，且对正常细胞无毒性作用［9］。我们构建了MDA⁃7／IL⁃24基因的腺病毒载体，通过腺病毒瘤内注射的方式来增加肝癌移植瘤组织中MDA⁃7／IL⁃24的表达，联合阿霉素腹腔注射后对肿瘤的生长情况进行了比较，结果表明，干预组小鼠肿瘤的体积和重量均明显小于模型组，D组小鼠肿瘤的体积和重量显著低于B组和C组。国内外学者也有类似的文献报道［10⁃11］，提示MDA⁃7／IL⁃24基因的腺病毒及阿霉素均能抑制肝癌的生长，腺病毒和阿霉素具有协同作用、联合使用能更有效地抑制肝癌的生长。

肝癌组织的生长依赖于新生血管所提供的养分及细胞向周围的浸润和侵袭［12］。VEGF是一类特异性的血管内皮细胞生长因子，具有不同亚型，通过与相应受体结合来促进肿瘤血管的形成。VEGFC是新生血管的主要诱导物，主要通过与VEGFR2结合来促进内皮细胞增殖、诱导肿瘤组织中新生血管的生成［13］。MMP家族分子是促进癌细胞浸润性生长的重要分子。由癌细胞合成和分泌的MMP3和MMP9能够降解细胞外基质中的Ⅴ、Ⅵ型胶原及层黏连蛋白等多种成分，进而促进癌细胞突破细胞外基质的限制并向邻近组织浸润性生长［14］。本研究中，干预组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR1 mRNA含量显著低于模型组，联合组小鼠肿瘤组织中MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR1 mRNA含量明显低于阿霉素组、MDA⁃7／IL⁃24组。说明MDA⁃7／IL⁃24基因的腺病毒及阿霉素均能抑制肝癌组织中VEGF和MMP的表达，腺病毒和阿霉素具有协同作用，联合使用能有效地抑制VEGF和MMP的表达。

本研究表明，MDA⁃7／IL⁃24基因联合阿霉素能够有效地抑制肝癌模型裸鼠的肿瘤生长，减少MMP和VEGF的表达量，这或许可以为肝癌治疗提供一种新的途径，其应用价值仍有待于更多基础研究与临床研究求证。

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（责任编辑：马 军）

EffectofMDA⁃7／IL⁃24genecombinedwithAdriamycinonmatrix metalloproteinase and vascular endothelial growth factor of hepatocarcinoma model nude mice

QIAN Heping，LIN Jiaxiao
1.Department of ICU，Haimen People’s Hospital，Haimen 226100；2.Department of Stomach and Liver Disease，Zhongda Hospital of Southeast University，China

Objective To investigate the effect of MDA⁃7／IL⁃24 gene combined with adriamycin on matrix metallo⁃proteinase and vascular endothelial growth factor（VEGF）of hepatocarcinoma model nude mice.Methods The model nude mice with transplanted hepatocellular carcinoma were constructed and divided into model group（group A），Adria⁃mycin group（group B），MDA⁃7／IL⁃24 group（group C）and combined intervention group（group D）.The groups were given different interventions.At 2 weeks and 6 weeks after the interventions，the gross tumor volume，weight，the ex⁃pression quantities of matrix metalloproteinases（MMP）and VEGF were measured.Results At 2 weeks and 6 weeks af⁃ter the interventions，the gross tumor volume and weight of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），the gross tumor volume and weight of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05），the mRNA levels of MMP3 and MMP9 in tumor tissues of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），the mRNA levels of MMP3 and MMP9 in tumor tissues of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05），the mRNA levels of VEGF⁃C and VEGFR2 in tumor tissues of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），and the mRNA levels of VEGF⁃C and VEGFR2 in tumor tissues of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05）.Conclusion MDA⁃7／IL⁃24 gene in combination with Adriamycin can effectively inhibit the tumor growth and reduce the expression quantities of MMP and VEGF in hepatocarcinoma model nude mice.

Hepatocarcinoma；Melanoma differentiated antigen⁃7；Interleukin⁃24；Matrix metalloproteinase；Vascu⁃lar endothelial growth factor

R735.7

A

1006－5709（2016）12－1471－04

2016⁃01⁃11

10.3969／j.issn.1006⁃5709.2016.12.049

江苏省卫生科研项目（P200911）

钱鹤平，研究方向：重症医学。E⁃mail：54241107＠qq.com