贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤免疫功能及血管内皮细胞生长因子的影响

殷鹏飞，杨小翠，郭联斌，贺永锋，魏玉梅

安康市中心医院1.消化病科；2.内镜室，陕西安康725000

贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤免疫功能及血管内皮细胞生长因子的影响

殷鹏飞1，杨小翠1，郭联斌1，贺永锋2，魏玉梅1

安康市中心医院1.消化病科；2.内镜室，陕西安康725000

目的 探究不同剂量贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤免疫功能及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）的影响。方法 选择雌性Balb／c裸鼠40只为研究对象，随机分为对照组、模型组、贝伐单抗高剂量组、贝伐单抗低剂量组各10只。模型组、贝伐单抗高剂量组、贝伐单抗低剂量组采用人胃癌细胞BGC⁃823接种到实验鼠皮下组织建立裸鼠模型，高剂量组用10 mg／kg贝伐单抗腹腔注射治疗，低剂量组用5 mg／kg腹腔注射，模型组与对照组注射等量生理盐水，4周后脱颈处死小鼠，比较肿瘤组织重量与抑瘤率、免疫功能、VEGF与微血管密度。结果 贝伐单抗干预组平均瘤重明显低于模型组（P＜0.05）；贝伐单抗高剂量组平均瘤重明显低于模型组，抑瘤率明显高于低剂量组（P＜0.05）；贝伐单抗干预组血清白细胞介素⁃1（IL⁃1）、白细胞介素⁃2（IL⁃2）、肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）含量明显高于模型组（P＜0.05）；高剂量贝伐单抗组血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α明显高于低剂量贝伐单抗组（P＜0.05）；贝伐单抗干预组VEGF、微血管密度（MVD）明显低于模型组（P＜0.05）；贝伐单抗高剂量组VEGF、MVD明显低于低剂量组（P＜0.05）。结论 贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤有明显的抑制作用，可能与增强免疫功能、抑制抗VEGF等机制相关，并呈现一定的剂量依赖性。

贝伐单抗；胃癌移植瘤；免疫功能；血管内皮细胞生长因子

【Key words】 Bevacizumab；Gastric cancer xenograft；Immunologic function；Vascular endothelial cell growth factor

胃癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，在城镇居民中排列第二，农村居民排列第一。由于我国尚缺乏早期胃癌的筛查机制，临床确诊的胃癌患者多为中晚期，总体生存率较低［1］。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）作为诱导血管内皮生成的关键因子，决定着实体瘤发生、发展及转移的全过程［2］。患者自身对癌细胞的免疫反应也与肿瘤对机体的伤害密切相关。贝伐单抗是一种用于靶向治疗的单克隆抗体，在晚期癌症治疗中有较为明显的疗效［3］，但对于癌症患者免疫功能与VEGF影响的文献报道较少。本文通过建立裸鼠移植瘤模型的方法，探讨贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤免疫功能及VEGF水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞BGC⁃823由上海消化外科研究所培养传代；贝伐珠单抗注射液、白细胞介素⁃1（IL⁃1）、白细胞介素⁃2（IL⁃2）、肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）试剂盒购自深圳晶美生物有限公司（批准文号：国药准字S20100024，规格100 mg∶4 ml）；免疫组化试剂盒：日本DAKO公司；CD34：美国Abcam公司；VEGF：北京博奥森生物技术有限公司；全自动生化分析仪：日本日立7600型；高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司DL⁃5M。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物：雌性Balb／c裸鼠40只，体质量12～16 g，平均（14.26±1.23）g，4～6周龄，平均（5.02±0.76）周龄，购自大学动物实验室（许可证号201512010），本研究报请医院动物伦理委员会批准。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型建立：将胃癌BGC⁃823悬液配置为1×107个／ml，用滴定管吸取0.1 ml接种于随机抽取的60只实验鼠皮下，1 d后观察接种部位是否出现红肿、溃破，若皮下结节长径达4 mm，8 d后皮丘大小达75～100 mm则可判断为移植瘤模型建立成功。

1.2.3 分组与治疗：将人胃癌细胞BGC⁃823皮下组织接种的30只实验鼠随机分为高剂量组、低剂量组和模型组，高剂量组用10 mg／kg贝伐单抗腹腔注射（1次／d），低剂量组用5 mg／kg腹腔注射（1次／3 d），模型组注射等量生理盐水，另取10只同批次实验鼠作为对照组，注射等量生理盐水。治疗4周后处理小鼠，检测指标。

1.3 观察指标

1.3.1 平均瘤重与抑瘤率：给药4周后，脱颈处死小鼠，剥离肿瘤称量，计算抑瘤率（%）＝（1－用药组平均瘤重／模型组平均瘤重）×100%。

1.3.2 免疫功能：给药4周后，取小鼠眼球血2 ml，凝固10 min后，3 000 r／min离心10 min（离心半径r＝3 cm）取上清液，检测血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α含量。

1.3.3 VEGF与微血管密度（microvessel density，MVD）：给药4周后，脱颈处理小鼠取肿瘤组织标本，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色观察肿瘤组织形态变化，采用Western blotting检测肿瘤组织VEGF表达，检测肿瘤组织MVD。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析，瘤重、免疫功能、VEGF等计量资料用x ±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织病理学检查 模型组肿瘤瘤体较大，质地较软，光学显微镜下可见表面呈淡红色，肿瘤细胞完整，毛细血管丰富，与周围组织分界清晰，肿瘤细胞排列紧密，切面渗血较多；贝伐单抗组肿瘤瘤体稍小，质地较韧，光学显微镜下表面呈灰白色，可见坏死性中央区，毛细胞血管减少，切面渗血较少，且贝伐单抗高剂量组细胞间隙更大（见图1～2）。

图1 三组小鼠肿瘤病理切片（HE 200×） A：模型组；B：低剂量组；C：高剂量组Fig 1 Tumor pathological sections of 3 groups of mice（HE 200×） A：model group；B：low dose group；C：high dose group

图2 三组小鼠移植瘤MVD（HE 200×） A：模型组；B：低剂量组；C：高剂量组Fig 2 Transplanted tumor in 3 groups of mice MVD（HE 200×） A：model group；B：low dose group；C：high dose group

2.2 肿瘤重量与抑瘤率 贝伐单抗干预组平均瘤重明显低于模型组（P＜0.05）；贝伐单抗高剂量组平均瘤重明显低于模型组，抑瘤率明显高于低剂量组（P＜0.05，见表1）。

2.3 免疫功能 模型组血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α含量明显低于对照组（P＜0.05）；贝伐单抗干预组血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α含量明显高于模型组（P＜0.05）；高剂量贝伐单抗组血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α明显高于低剂量贝伐单抗组（P＜0.05，见表2）。

2.4 VEGF与MVD 模型组VEGF、MVD明显高于对照组（P＜0.05）；贝伐单抗干预组VEGF、MVD明显低于模型组（P＜0.05）；贝伐单抗高剂量组VEGF、MVD明显低于低剂量组（P＜0.05，见表3）。

表1 三组小鼠平均瘤重与抑瘤率比较（x ±s）Tab 1 Comparison of average tumor weight and tumor inhi⁃bition rate of mice among 3 groups（x ±s）

表2 四组小鼠血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α含量比较（x±s，ng／L）Tab 2 Comparison of serum levels of IL⁃1，IL⁃2，TNF⁃α of mice among 4 groups（x±s，ng／L）

表3 四组小鼠VEGF与MVD比较（x ±s）Tab 3 Comparison of VEGF and MVD of mice among 4 groups（x ±s）

3 讨论

贝伐单抗是应用于临床的第一个抗血管药物，可以有效阻断VEGF对肿瘤增殖、分化、迁移的作用，能够有效抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤血供，降低血管通透性与肿瘤内间质压［4］。多项药物试验和临床研究表明贝伐单抗在结肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等表现为实体结构的肿瘤中有明显的治疗作用［5］。贝伐单抗是一种中和性抗体，其作用主要是抑制和破坏肿瘤血管内皮细胞，但并不直接阻断在肿瘤细胞内复杂的信号传导［6］。在抗肿瘤效果上，贝伐单抗干预组肿瘤重量明显低于模型组，且呈剂量依赖性关系，Jin等［7］也有类似的文献报道。

机体免疫功能低下是导致肿瘤发生、发展的重要原因，细胞因子在抗肿瘤治疗中的作用也越来越受到重视。IL⁃1属细胞因子家庭中一员，是联系免疫系统与人体其他系统的有效介质，其中一种类型IL⁃1β是一种机制防御反应的具有免疫调节功能的炎性细胞因子［8］；IL⁃2是一种具有多向性与免疫功能强化有关的细胞因子，是反映机体免疫功能的重要指标，能够激活杀伤细胞（LAK）与干扰素，导致肿瘤细胞发生程序性死亡［9］；TNF⁃α具有直接抑制或杀伤肿瘤细胞的作用，也可通过介导免疫应答，造成肿瘤微血管损伤，抑制肿瘤血管形成，诱发肿瘤出血坏死［10］。贝伐单抗的抗肿瘤效果已经得到了公认，贝伐单抗的免疫调节作用也逐渐为人们所关注［11］。本研究中，贝伐单抗干预组血清IL⁃1、IL⁃2、TNF⁃α含量均明显高于模型组，且高剂量组干预效果更好。

VEGF是诱导血管生成的关键因子，与肿瘤的发生、进展及侵犯深度、淋巴结及远处转移等恶性生物学行为密切相关［12］。在胃癌组织及患者血清中，VEGF是独立预后因子之一［8］，也是药物治疗的潜在靶点。周尘飞等［13］通过动物实验证实，贝伐单抗能减少肿瘤内MVD和VEGF表达，本文研究结果也支持这一观点。

本研究结果表明，贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤有明显的抑制作用，可能与增强免疫功能、抑制抗VEGF等机制有关，且高剂量贝伐单抗在短期内疗效更为显著，其远期疗效及可能作用机制还有待更进一步的研究。

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（责任编辑：马 军）

Effects of Bevacizumab on the immunologic function and vascular endothelial cell growth factor of nude mice’s gastric cancer xenograft

YIN Pengfei1，YANG Xiaocui1，GUO Lianbin1，HE Yongfeng2，WEI Yumei1
1.Department of Gastroenterology；2.Department of Endoscope Room，the Center Hospital of Ankang，Ankang 725000，China

Objective To investigate the effects of Bevacizumab of different doses on the immunologic function and vascular endothelial cell growth factor（VEGF）of nude mice’s gastric cancer xenograft.Methods Forty female Balb／c nude mice were selected as object and divided into control group，model group，high⁃dose Bevacizumab group and low⁃dose Bevacizumab group with 10 mice per group.Method of inoculating human gastric carcinoma cells BGC⁃823 to the subcutaneous tissues of laboratory mice was adopted in model group，high⁃dose Bevacizumab group and low⁃dose Bevaci⁃zumab group in order to establish nude mice model；10 mg／kg Bevacizumab intraperitoneal injection was used in high⁃dose Bevacizumab group while 5 mg／kg Bevacizumab intraperitoneal injection was used in low⁃dose Bevacizumab group；equivalent normal saline injection was applied in the control group and model group.Four weeks later，mice were killed by cutting necks.Weights and anti⁃tumor rates of tumor tissues，immunologic function，VEGF as well as microvessel density were compared.Results The average tumor weights in Bevacizumab intervention group were apparently lower than those in model group；the average tumor weights in high⁃dose Bevacizumab group were apparently lower than those in model group and anti⁃tumor rate in high⁃dose Bevacizumab group was apparently higher than that in low⁃dose Bevaci⁃zumab group（P＜0.05）；content of serum interleukin⁃8（IL⁃1），interleukin⁃2（IL⁃2）and tumor necrosis factor⁃α（TNF⁃α）in Bevacizumab intervention group was apparently higher than that in model group（P＜0.05）；VEGF and mi⁃crovessel density（MVD）in Bevacizumab intervention group were apparently lower than those in model group（P＜0.05）；VEGF and MVD in high⁃dose Bevacizumab group were apparently lower than those in low⁃dose Bevacizumab group（P＜0.05）.Conclusion Bevacizumab had an obvious inhibiting effect on nude mice’s gastric cancer xenograft，which may be related with mechanisms including immune⁃enhancement function and the inhabitation of VEGF.Besides，Bev⁃acizumab was also found to be dose⁃dependent to some extent.

R735.2

A

1006－5709（2016）12－1455－04

2016⁃03⁃09

10.3969／j.issn.1006⁃5709.2016.12.045

陕西省科技攻关基金资助项目（06k11⁃G4）

殷鹏飞，主治医师，研究方向：炎症性肠病、胃肠疾病、消化道肿瘤的诊治。E⁃mail：54241107＠qq.com