低频电磁辐射对小鼠近日节律的影响*

杨运康　刘延友　后望　王正荣

(四川大学华西基础医学与法医学院· 卫生部时间生物学研究室， 四川 成都 610041)

·论著·

低频电磁辐射对小鼠近日节律的影响*

杨运康刘延友后望王正荣△

(四川大学华西基础医学与法医学院· 卫生部时间生物学研究室， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探究2000μW/cm2电磁辐射对小鼠运动节律和Clock基因表达水平的影响。方法将4周龄的雄性昆明鼠30只随机分为三组：空白组，1h/d辐射组，2h/d辐射组。固定小鼠，使其接受2000μW/cm2电磁辐射，连续10天，之后监测其转轮活动的近日节律变化，并且提取小鼠脑组织中的总RNA和蛋白， RT-PCR和western-blot检测三组之间Clock基因和蛋白的表达是否存在显著性差异。结果与空白组相比，两个辐射组小鼠近日节律均有缩短的现象(P<0.05)，且Clock基因和蛋白的表达水平显著性的升高(P<0.05)。结论2000μW/cm2电磁辐射会缩短小鼠的近日节律周期，其机制可能与Clock基因表达升高有关。

【关键词】电磁辐射；近日节律；生物钟基因；Clock基因

近日节律是机体适应环境周期性变化的一种内在机制，具有重要的生理功能[1]。分子水平上，近日节律是由一系列的核心近日钟基因的转录负反馈环路所产生，近日钟基因参与调控细胞的生理生化活动，如细胞增值、细胞凋亡等[2，3]。随着科技的进步，电磁波的应用也得以普及，它在给人类的日常生活带来便利的同时，也带来了许多的弊端，各个种类的电子产品所发射出的电磁波不仅对地球和大气带来破坏，更严重的是影响到了人体的健康[4，5]。有研究报道，2000μW/cm2电磁辐射可导致小鼠学习记忆功能下降，其机制可能与海马体组织蛋白及其mRNA的表达下降有关[6]。低强度微波辐射(150μW/cm2)能通过影响雄性小鼠血清总胆固醇含量、 睾丸组织P450scc mRNA的表达，影响血清睾酮的合成和分泌，进而影响雄性小鼠生殖系统的其他相关指标[7]。低强度电磁辐射影响大鼠松果体中第二信使cAMP, cGMP，从而干扰松果体细胞信号转导系统，进一步影响动物的昼夜节律[8]。生物节律系统在维持生物体内环境稳态，保证生物体日常生理活动正常进行方面具有重要作用，而相关的节律基因则处于该系统的核心位置。Clock是节律调控通路中最核心的元件[9-11]，电磁辐射对生物节律的影响还少有报道，本文主要探讨电磁辐射对生物的近日节律和生物钟基因的影响。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物昆明小鼠30只，4周雄性，购于四川大学华西校区实验动物中心。

1.1.2主要试剂Trizol 试剂(美国，Inxitrogen)， DEPC(美国，Sigma)，PCR Mix(中国，novoprotein)，DNA Leader2000(中国，novoprotein)，HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(北京，康为世纪)，RIPA蛋白裂解液(中国，碧云天)，预染蛋白Marker(美国，Fermentas)，ECL检测试剂盒(中国，全式金)，CLOCK抗体(美国，Epitomics)，抗GAPDH抗体(中国，康为)，辣根酶过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(中国，中杉金桥)辣根酶过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体(中国，中杉金桥)其它试剂为国产分析纯。

1.1.3主要仪器普通PCR仪(德国，Eppendorf)，低温离心机(德国，Eppendorf)，微量移液器(德国，Eppendorf)，琼脂糖凝胶电泳槽装置(中国，俊逸)，转轮装置节律监测仪，电磁波发生器等。

1.1.4引物序列引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列见表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1动物分组及饲养将30只4周龄的雄性昆明鼠，饲养于24小时全黑环境，自由饮水进食，温度为22～24℃，湿度50～65%，控制环境噪音。饲养两周时间，使小鼠适应周围环境，利用小鼠节律检测仪监测每只小鼠的转轮活动，待其跑出有规律且稳定的近日活动图后，将小鼠随机分为3组：对照组，1h/d辐射组，2h/d辐射组。

1.2.2辐射处理对其中两组分别采用2000μW/cm2强度的电磁波进行每天1小时和2小时辐射，用鼠板固定小鼠，辐射探头置于小鼠头部正上方，范围为以探头为圆心，半径15cm的圆形区域，小鼠全身接收照射。1h/d辐射组辐射时间为上午8:00～9:00，2h/d辐射组为上午8:00～10:00，连续辐射10天；对照组小鼠每天8:00～10:00固定2小时，不做辐射处理。

1.2.3活动节律监测采用转轮装置自辐射前5日起至辐射结束后连续监测小鼠自发主动活动变化，搜集数据与对照组进行比较分析。

1.2.4RT- PCR用液氮将脑组织充分研磨后，加入Trizol试剂，按照说明书提取组织的RNA，检测RNA的浓度和质量。按照逆转录试剂盒的说明书，将上述RNA逆转录为cDNA。根据PCR mix提供的说明书，配置反应体系进行PCR实验，琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带。

1.2.5Western blot用液氮将脑组织充分研磨后，加入RIPA(强)裂解液，按照说明书的操作流程，提取组织的总蛋白。BCA法检测蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并且将蛋白转膜到PVDF，western-blot检测三组CLOCK和GAPDH蛋白的表达水平。

1.2.6数据分析Quantity one软件半定量分析条带的相对光密度值；利用SPSS软件对三组样品的相对单位光密度值进行独立样本t检验，P<0.05表示两组间差异有统计学意义。

2结果

2.12000μW/cm2电磁辐射对小鼠近日节律的影响实验组小鼠接受辐射前后的自发主动活动节律图如图1所示，其中箭头所示为辐射开始时间，A为每天接受2000μW/cm2低强度电磁波辐射1小时，辐射时间为上午8：00-9：00，连续辐射10天，B为每天接受2000μW/cm2低强度电磁波辐射2小时，辐射时间为上午8：00～10：00，连续辐射10天，C为对照组没有进行辐射处理。从图中可以看出，辐射前两组实验组节律周期与对照组相比没有显著差异(P>0.05);而辐射后，两组辐射组小鼠的近日节律周期均比对照组短(P<0.05)，1h/d辐射组和2h/d辐射组小鼠近日节律无显著差异(P>0.05)。

2.22000μW/cm2电磁辐射对小鼠Clock基因表达量的影响图2是对1h/d辐射组和2h/d辐射组进行辐射处理后，利用RT-PCR检测辐射组和对照组小鼠clock mRNA表达的结果，其中图2A中1、2、3条带是1h/d辐射组，4、5、6是2h/d辐射组，7、8、9是对照组，图2B为三组相对光密度，对照组为1.2±0.2，1h/d辐射组为2.8±0.2，2h/d辐射组为3.1±0.2。由图可知，两组实验组小鼠clock表达均显著高于对照组，存在显著差异(P<0.05)，而1h/d辐射组和2h/d辐射组两组无显著差异(P>0.05)。

2.3Western Blot检测辐射后实验组和对照组小鼠CLOCK表达图3是对1h/d辐射组和2h/d辐射组进行辐射处理后，利用western blot检测辐射组和对照组小鼠CLOCK表达的结果，其中图3A中分别为对照组、1h/d辐射组和2h/d辐射组的结果，图3B为三组相对光密度，对照组为1.6±0.2，1h/d辐射组为3.2±0.2，2h/d辐射组为3.6±0.2。由图可知，两组实验组小鼠CLOCK表达均显著高于对照组，存在显著差异(P<0.05)，而1h/d辐射组和2h/d辐射组两组无显著差异(P>0.05)。

图1三组小鼠自发主动活动节律图

Figure 1The self-sustained locomotor circadian rhythm of mice

图2RT-PCR检测辐射后实验组和对照组小鼠Clock表达

Figure 2The relative mRNA level of Clock

3讨论

本次试验以小鼠为研究对象，研究2000μW/cm2强度低频电磁波辐射对近日节律的影响，实验结果表明，每天接受1小时和2小时2000μW/cm2强度低频电磁波持续辐射10天，会显著性的缩短小鼠的自发主动活动节律周期，同时会显著性的增加clock 基因mRNA和蛋白的表达水平。

Clock是生物体的核心近日钟基因，与Bmal1一起构成负反馈环路的正性元件[12]。给予小鼠2000μW/cm2强度低频电磁波辐射，会增加Clock的表达水平，同时会缩短小鼠的运动近日节律的周期，说明小鼠近日节律的缩短可能与Clock的表达水平增加有关。

图3western blot检测辐射后实验组和对照组小鼠CLOCK表达

Figure 3The relative protein level of CLOCK

目前，已有大量研究证明哺乳动物体内存在由核心近日钟基因所构成的核心通路和辅助通路[13]，参与调控机体的各项生理活动[14]。研究报道，动物体内Clock基因表达出现异常时，会导致体内多种细胞的活力显著下降，而且体内免疫细胞数目也会降低[15]。

哺乳动物体内的近日钟具有核心的负反馈环路， CLOCK和BMAL1两种蛋白质所构成的异二聚体可以结合在mPer1/2/3、Cry1/2基因上游的E-box区域，促进了mPer、Cry基因的转录[16,17]，当细胞质内PER、CRY蛋白的浓度增加到一定的程度，又会反过来抑制CLOCK:BMAL1二聚体的活性，从而抑制的mPer、Cry的转录，构成负反馈环路，形成周期约为24小时的节律振荡[18]。本实验中，辐射组的近日节律周期比对照组显著缩短，同时Clock基因表达显著上升，故推测低频电磁波辐射导致小鼠脑组织中Clock基因表达的上升，影响了核心的负反馈环路，从而改变了近日振荡周期。

近日节律系统是机体适应环境周期性变化的一种内在机制，改变节律基因的表达水平是近日节律参与调控机体生理活动的重要的手段之一[19,20]。本研究发现，经过10天持续的2000μW/cm2强度低频电磁波辐射后，小鼠的近日节律周期缩短，而Clock的表达有明显的上升，证明了低频电磁波会影响生物体的近日节律系统，而其中涉及到的分子机制值还需要更加深入的研究探讨。

4结论

本实验研究结果发现， 2000μW/cm2强度低频电磁波辐射影响小鼠的近日节律，表现为小鼠的运动节律周期缩短，小鼠脑组织中clock 基因mRNA和蛋白的表达水平升高，推测低频电磁波辐射，可能通过改变clock 基因的表达水平影响小鼠的自发主动运动节律的周期。揭示了低频电磁辐射对生物体近日节律的影响机制，证明日常生活中存在的各种电磁辐射会影响人体的健康。

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The effect of low frequency electromagnetic waves on the circadian rhythm in mice

YANG Yunkang, LIU Yanyou, HONG WANG, et al

(KeyLaboratoryofChronobiology,MinistryofHealth(SichuanUniversity),WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of 2000μW/cm2 electromagnetic radiation on the circadian rhythm and the expression level of Clock in mice. Methods30 male Kunming mice were randomly divided into control group, 1h/d radiation group and 2h/d radiation group. Mice in radiation group were fixed and accepted 2000μW/cm2 electromagnetic radiation for 10 days. Biological rhythm monitor was used to detect the locomotor circadian rhythms of mice. Total RNAs and proteins of brain tissue were extracted. RT-PCR and western-blot were used to detect the expression level of mRNA and protein. ResultsThe period of the circadian rhythm in the two radiation groups were shorter than that of control group (P<0.05), and the mRNA and protein level Clock were both increased, when compared with that of control group (P<0.05). Conclusion2000μW/cm2 electromagnetic radiation could shorten the period of circadian rhythm in mice, which might be associated with the increased expression of Clock.

【Key words】Electromagnetic radiation; Circadian rhythm; Clock gene

基金项目：国家自然科学基金(31371180)

通讯作者：王正荣，教授，本刊常务编委，E-mail：wangzhengrong@126.com。

【中图分类号】R 318.03

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.011

(收稿日期：2016-01-19； 编辑： 张文秀)