Hsp70对慢性心理应激小鼠胚胎在体外培养中的作用

李小红　李尚为　罗珊　樊伟　曾珣　白瑜

(四川大学华西第二医院生殖医学中心， 四川 成都 610041)

·论著·

Hsp70对慢性心理应激小鼠胚胎在体外培养中的作用

李小红李尚为罗珊樊伟曾珣白瑜

(四川大学华西第二医院生殖医学中心， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探讨HSP70能否对慢性轻度不可预见性应激(CUMS)小鼠2-细胞胚胎在体外培养的环境中起到应激保护作用。方法设立对照组，构建CUMS雌性昆明小鼠模型，予以PMSG/HCG促排卵获取2-细胞胚胎，置于M16培养液中培养48小时，观察优胚率及囊胚形成率， 免疫荧光检测Hsp70及Caspase-3在胚胎的表达情况，共培养囊胚与Ishikawa 细胞观察粘附率，并进行统计学分析。结果实验组的优胚率和囊胚率分别为62.2%和20.6%，均低于对照组的89%和31%，差异有统计学意义(P<0.05)。HSP70在实验组胚胎中阳性表达率为86.67%,高于对照组的30%，差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3在实验组及对照组之间阴性表达率无统计学差异(P<0.05)。实验组胚胎的粘附率为20%，低于对照组的30%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论HSP70可能对CUMS小鼠2-细胞胚胎在体外培养的环境中起到应激保护作用，该作用可能通过抗凋亡因子(caspase-3)实现。

【关键词】热休克蛋白70；慢性轻度不可预见性应激；2-细胞胚胎；体外培养；caspase-3

胚胎体外培养是人类辅助生殖技术重要且关键的环节，优质胚胎及囊胚的获得则是助孕成功的先决条件。由于胚胎体外培养系统并不能完全模拟女性生殖道的微环境，因此，体外培养的胚胎可能要面对氧化应激，温度变化和完全改变的细胞环境，往往发育潜能降低[1-3]。

热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是机体在应对各种不同应激刺激下所做出的细胞防御反应，是一种应激保护因子。在体外培养的胚胎其HSP70.1的表达水平明显高于体内胚胎，对体外培养的鼠胚和猪胚给予热应激和高氧应激，HSP70的表达显著升高[4，5 ]。在相同培养液中培养不同数目的牛胚，其Hsp70.1转录体也明显不同[6]。

课题组前期建立了慢性轻度不可预见性应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)雌性昆明小鼠模型，研究发现CUMS诱导HSP70在昆明小鼠卵泡、2-细胞胚胎和孕4天胚胎中阳性表达，可能参与应激胚胎的保护作用[7]。如果将CUMS小鼠2-细胞胚胎置于体外培养的环境中，HSP70能否继续发挥其应激保护作用，本研究将对此进行初步探讨。

1材料与方法

1.1实验动物昆明纯种小鼠，购于四川大学实验动物中心(动物合格证号: SCXK(川)2013-026)。其中雌性小鼠20只，4～5周龄，体质量18～22g，每笼饲养5只；雄性小鼠5只，5～6周龄，体质量22～25g，每笼1只单独饲养，合笼备用。正常饲养条件为自由摄食、饮水，12小时光照，环境温度18～22℃，相对湿度40%～60%。雌性小鼠正常饲养5天后采用随机数字表法将其分为对照组(5只)和实验组(CUMS超排组，15只)。

1.2CUMS造模方法采用课题组前期研究的方法[8]，以9种应激因子在28天内随机应用，每日一种，每种累计2～4次，使动物不能预料刺激的发生。9种应激因子如下：①潮湿垫料和倾斜饲养24小时(将200ml水加入有垫料的笼底，并将小鼠笼子倾斜45°)。②禁食24小时。③禁水24小时。④高温10min(40℃环境)。⑤夹尾1min(距尾根1cm夹铁质小书夹)。⑥4℃冰水游泳5min。⑦束缚应激4小时。⑧陌生异常物品(如塑料杯、木勺、碎布片等)。⑨孤养24小时。

CUMS刺激28天后采用旷场实验及糖水消耗实验验证建模是否成功，成功后进入下一步研究。

1.3超排卵方案实验组及对照组性成熟雌性小鼠于下午4时腹腔内注射孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG，天津实验动物中心)10U，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG，上海生物化学制药厂)10 U。

1.42-细胞胚胎的获取及培养PMSG/HCG促排卵，HCG注射后即与性成熟雄鼠2∶1 合笼，次日8时观察阴栓并与雄鼠分开，见阴栓当日为孕1天。孕2天下午2时(相当于见阴栓后30小时或HCG注射后46小时)采用脱臼法处死雌性小鼠，于卵巢与子宫之间找到并取出双侧输卵管，在解剖显微镜下以1号注射器针尖纵行拨开输卵管，以M2培养基冲洗，寻找2-细胞期胚胎并计数。

将获得的2-细胞胚胎以毛细玻璃吸管转移至M2操作液中清洗两次，再转移至平衡过夜后的M16培养基中培养，15～20个胚胎/滴。将培养皿置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养48小时，然后置于体视显微镜下观察并记录胚胎发育情况。

1.5小鼠胚胎的评分标准小鼠胚胎的评分参照人类胚胎的评分标准[9]，共分为六级胚胎，其中一级、二级和三级胚胎定为优质胚胎。一级胚胎评分标准为卵裂球均匀规则, 折光度适中, 透明带完整，无碎片或碎片体积小于胚胎体积的10%；二级胚胎为卵裂球不均匀欠规则, 折光度稍差,碎片体积小于胚胎体积的10% ; 三级胚胎为碎片体积小于胚胎体积的50%, 剩余卵裂球形态和折光度与二级胚胎相当, 透明带完整。

1.6胚胎免疫荧光染色将体外培养48小时的优质胚胎进行免疫荧光染色。基本步骤：①4%多聚甲醛室温固定15分钟，PBS洗3次。②含0.1%Triton的PBS室温打孔10分钟，PBS洗3次。③含3%BSA的PBS封闭30分钟，37℃。④1∶100稀释的hsp70一抗或Caspase-3一抗，4℃过夜，PBS洗3次。⑤1∶100稀释的羊抗鼠荧光二抗，37℃，30分钟，PBS洗3次。⑥0.5μg/mlHoechst33258染核30分钟，PBS洗3次。⑦甘油封片，在共聚焦显微镜下观察并拍照。

该实验每次均设有阴性对照组，即封闭液代替一抗孵育过夜。阳性界定为激光共聚焦下见明亮的红色荧光、各细胞期胚胎的细胞轮廓能够清晰地呈现：阴性则看不到明亮的红色荧光。

1.7囊胚体外粘附实验将Ishikawa细胞接种于24孔板中，培养至90～95%融合时加入1ml M16培养液，将在体外培养48小时形态良好的囊胚移入培养孔中，继续培养48小时后将培养板置于倒置显微镜下观察囊胚的粘附情况。观察时轻微晃动培养板，位置没有发生变化的囊胚记为粘附的囊胚，计算并比较各组间的粘附率。

2结果

2.1CUMS小鼠2-细胞胚胎在体外培养48小时后发育情况5只对照组小鼠获得2-细胞胚胎100枚，15只实验组小鼠获得2-细胞180枚。将获得的实验组和对照组2-细胞胚胎分别放在M16培养液中，培养48小时后观察，实验组的优胚率和囊胚率分别为62.2%和20.6%，均低于对照组的89%和31%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2HSP70和Caspase-3在体外培养48小时的CUMS小鼠胚胎中的表达将培养48小时获得的优质胚胎采用免疫荧光法检测HSP70和Caspase-3的表达，在激光共聚焦显微镜下观察并采图，每组30枚。结果显示，HSP70在实验组胚胎中主要呈阳性表达，表达部位在透明带，见图1；其阳性表达率为86.67%,高于对照组的30%，差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3在实验组及对照组主要呈阴性表达，两者之间阴性表达率无统计学差异，见表2。

表1　小鼠2-细胞胚胎在体外培养后发育情况

注：优胚率和囊胚率的比较采用2检验。

图1免疫荧光测定HSP70在体外培养48小时胚胎中的表达

Fig.1The expression of HSP70 in 48 hr embryos cultured in vitro by immunofluorescence method

注：结果显示，HSP70在实验组主要呈阳性表达(红色荧光)，在对照组中主要呈阴性表达

表2免疫荧光法检测HSP70和Caspase-3在体外培养48小时胚胎中的表达

Table 2　Expression of HSP70 and Caspase-3

注：率的比较采用2检验。

2.3囊胚体外粘附实验将培养获得的形态良好的囊胚进行体外粘附实验，每组各30枚。结果显示，实验组胚胎的粘附率为20%，低于对照组的30%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　体外培养囊胚的粘附实验[n(×190-2)]

注：粘附率的比较采用2检验

3讨论

不孕症及经历人类辅助生殖技术治疗过程都具有心理应激的特点，目前大量文献已经证实心理应激对生殖功能的负面影响，包括影响月经，降低卵巢储备功能和影响IVF成功率等[10-12]。本研究构建的CUMS雌性昆明小鼠模型是运用情绪应激的方法，使动物出现抑郁状态、兴趣丧失、快感缺乏等表现，与人体抑郁症的临床表现类似。前期研究已经发现其是一种生殖功能减退的情绪应激动物模型[8]。本研究将CUMS小鼠的2-细胞胚胎在体外培养48小时后观察发现，其优胚率及囊胚形成率均明显低于对照组，进一步做囊胚体外粘附实验也发现其粘附率低于对照组，说明受到心理应激影响的2-细胞胚胎再次面临体外培养的应激时，发育潜能进一步降低。

胚胎在体外培养的环境中同样面临应激的状态。胚胎培养介质可能会影响牛和小鼠胚胎的基因表达和基因印迹状态[13-15]，体外培养的猪胚发育至囊胚的潜能及质量均较体内获得者降低[16]。本项目前期研究发现HSP70在CUMS昆明小鼠体内2-细胞胚胎中呈阳性表达，可能对体内应激胚胎起到保护作用[7]。本研究是将体内来源的CUMS小鼠2-细胞胚胎置于M16培养液中进行体外培养48小时，结果发现，在优质胚胎中HSP70的阳性表达率明显高于对照组，提示HSP70可能对CUMS小鼠2-细胞胚胎在体外培养的环境中起到应激保护作用。但具体分子机制尚不清楚。

HSP70的抗凋亡作用体现在其表达水平升高后，可以降低或阻断caspase的活化，抑制线粒体损伤和核裂解[17,18]。caspase-3为caspase家族中关键的执行分子，在凋亡的早期阶段被激活，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。在我们的研究中，CUMS小鼠2-细胞胚胎在体外培养48小时后，在获得的优质胚胎中，HSP70阳性表达率高者caspase-3阴性表达率高，提示HSP70的应激保护作用可能与其拮抗caspase-3的抗凋亡作用有关。

4结论

通过体外培养CUMS小鼠2-细胞胚胎，我们发现其发育潜能降低，在获得的优质胚胎中HSP70阳性表达率升高，caspase-3阴性表达率升高，提示HSP70可能对CUMS小鼠2-细胞胚胎在体外培养的环境中起到应激保护作用，该作用可能通过抗凋亡因子(caspase-3)来实现。

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The effect of Hsp70 on 2- cells embryos in the mouse with chronic unpredictable mild stress in vitro

LI Xiaohong, LI Shangwei, LUO Shan,et al

(ReproductiveMedicalCenter,WestChinaSecondUniversityHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore whether HSP70 can play a protective role in 2- cells in vitro in the mouse with chronic unpredictable mild stress(CUMS). MethodsWe established an animal model of CUMS using female Kunming mice and administrated PMSG/hCG for induction of superovulation. After obtained 2- cell embryos, we cultured them in M16 culture medium for 48 hours and observed the rate of good quality embryos and blastocyst formation. We detected the expression of HSP70 and Caspase-3 in the embryos by immunofluorescence method and calculated the adhesion rate of embryos to endometrial epithelial Ishikawa cells in vitro. ResultsThe good quality embryo rate and blastocyst formatiaon rate of the experimental group were 62.2% and 20.6% respectively. Both of which were significantly lower than that of the control group (89% and 31%, P<0.05). The positive expression rate of HSP70 in the experimental group was 86.67%, which was significantly higher than that in the control group (30%, P<0.05). There was no significant difference in both groups about the negative expression rate of Caspase-3. When cultured the embryos with Ishikawa cells for 48 hours, we observed that the adhesion rate of the experimental group was 20%, which was lower than that of the control group (30%, P<0.05). ConclusionHSP70 may play a protective role in 2- cells of CUMS mouse in vitro, which may be realized by anti apoptotic factors (caspase-3).

【Key words】Heat shock protein70; Chronic unpredictable mild stress; 2-cell embryo; Culture in vitro; Caspase-3

【中图分类号】R 329.1

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.007

(收稿日期：2016-02-26； 编辑： 张文秀)